HPLC法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量

作者：张艳秋 ，洪金波 ，刘文林

【摘要】 目的：建立裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量测定方法，考察海南五指山地区野生裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量。方法：采用高效液相色谱法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量，乙腈-甲醇- 3.5 %乙酸胺水溶液(69∶10∶21)为流动相；流速为1 ml/min，检测波长为215 nm。结果：齐墩果酸与熊果酸的线性范围分别为1.63～6.53 μg(r=0.999 6) 与1.20～7.20 μg (r=0.999 7)，回收率分别为98.11% 和101.64% 。结论：本法操作简单，测定结果准确，适于裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量测定。

【关键词】 裸花紫珠；齐墩果酸；熊果酸；高效液相色谱法

［abstract］ objective: to establish a method for quality control of oleanolic acid and ursolic acid in folium callicarpae nudiflorae,which is originally grew in the five?finger mountain area. methods: the content of oleanolic acid and ursolic acid in folium callicarpae nudiflorae were determined by high performance liquid chromatography(hplc). the analytical column was c18(250 mm×4.6 mm,5 μm) .the mobile phase consisted of acetonitrile?methanol?3.5%ammonium acetate (69∶10∶21) ,the flow rate was 1.0 ml/min. the uv detection wavelenghth was 215 nm. results: oleanolic acid and ursolic acid showed a good linearity in range of 1.63～6.53 μg(r=0.999 6) and 1.2～7.2 μg (r=0.999 7) .the average recovery was 98.11% ,101.64%, respectively. conclusion: the method is a simple, convenient, accurate and relable， and it can be used to quality control of folium callicarpae nudiflorae .

［key words］ folium callicarpae nudiflorae ; oleanolic acid；ursolic acid; high performance liquid chromatography (hplc)

裸花紫珠药材为马鞭草科植物裸花紫珠（callicarpa nudiflorea hook. et arn.）的干燥叶，具有消炎、解毒、收敛、止血作用，用于治疗化脓性炎症、急性传染性肝炎、外治烧伤、烫伤、外伤出血等，是海南黎族民间常用的一味药材。

在海南黎族民间验方基础上，经现代研究发展而成的裸花紫珠片与复方木麻，就是以裸花紫珠为主药的成方制剂，前者用于治疗胃出血及病毒性肝炎，后者用于治疗寒湿痢疾。裸花紫珠药材主产海南五指山地区，由于裸花紫珠药材化学研究较少，化学成分不明确，其含量测定指标难以建立，给药材质量控制带来困难。最新研究文献报道，从裸花紫珠中分离出了具有抗菌消炎作用的齐墩果酸、熊果酸以及黄酮类成分［1］，我们经对其进行薄层色谱及高效液相色谱（hplc）分离检测发现，裸花紫珠中所含齐墩果酸与熊果酸含量很高，以两者作为含量测定指标对裸花紫珠药材进行质量控制具有实际意义。本实验系用hplc法对裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸含量进行了测定，为进一步进行新制剂开发和质量控制提供科学依据。

1 仪器、试剂与样品

waters高效液相色谱仪（delta600泵，2487检测器）；milennium色谱工作站；齐墩果酸与熊果酸化学对照品购自中国药品生物制品检定所 ；裸花紫珠药材采自海南省五指山区，由本所鉴定；乙腈、甲醇为色谱纯，其它均为分析纯试剂。水为自制纯化水。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性

色谱柱：lichrospher c18(250 mm×4.6 mm,5 μm) ，流动相：乙腈-甲醇-3.5 %乙酸胺水溶液(69∶10∶21)，流速为1 ml/min，检测波长为215 nm，柱温30 ℃，进样量20 μl。在此条件下，取裸花紫珠供试品溶液、齐墩果酸与熊果酸对照品溶液分别进样，所得色谱图见图1a、b，齐墩果酸与熊果酸能有效分离。a.齐墩果酸(oleanolic acid） b.熊果酸（ursolic acid）

图1 齐墩果酸与熊果酸对照品（a）、裸花紫珠（b）的 hplc色谱图

张艳秋等.hplc法测定裸花紫珠中齐墩果酸与熊果酸的含量 2．2 供试品溶液的制备

取本品60～65 ℃干燥，粉碎成粗粉，精密称取约0.3 ～0.5 g，置烧瓶中加乙醇30 ml，加热回流提取2次，每次1 h，合并乙醇提取液，滤过，滤液置蒸发皿中，再以30 ml乙醇分次洗涤药渣及滤器，洗液并入蒸发皿中，水浴蒸干乙醇，残渣以石油醚（60～90 ℃）浸洗2次，每次25 ml，2 min，倾去石油醚，残渣加甲醇适量多次洗涤，洗液定量转移至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察

2.3.1 齐墩果酸线性关系考察 精密称取齐墩果酸8.19 mg（纯度99.6%），置于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得齐墩果酸对照品溶液的储备液。精密吸取该对照品溶液的储备液2.5、4.0、5.0、7.5、10 ml分别置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密进样20 μl，按前述hplc条件测定，以对照品溶液浓度（c）对峰高度(h)进行回归，回归方程为:h=285c-6 712，r=0.999 6，结果表明齐墩果酸在81.6～326.3 μg/ml（1.63～6.53 μg）范围内呈良好的线性关系。

2.3.2 熊果酸线性关系考察 精密称取熊果酸对照品12.75 mg （纯度98.0%）于25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得熊果酸对照品溶液的储备液。精密吸取该对照品溶液的储备液0.6、1.2、1.6、2.4、3.0、3.6 ml分别置于5 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，各精密进样20 μl，按前述hplc条件测定，以对照品溶液浓度（c）对峰高度(h)进行回归， 回归方程为h=178c-212，r=0.999 7，结果表明熊果酸在60～360 μg/ml（1.20～7.20 μg）范围内呈良好的线性关系。

2．4 精密度试验

吸取同一供试品溶液依法分别重复进行5次测定，记录峰高度值测得熊果酸、齐墩果酸5次连续进样变异系数分别为1.6%、1.6% ，表明连续进样重复性良好。

2．5 重现性试验

按样品测定法对同一样品分取5份，同法处理，分别以峰高度值计算齐墩果酸、熊果酸含量, 结果变异系数分别为1.7%、2.2%，表明重现性良好。

海南医学院学报 vol.15 no.1 feb.20092．6 稳定性考察

取同一供试品溶液分别在1、4、6、8 h进行峰高值测定，测得8 h内熊果酸峰高变异系数rsd =0.98%，齐墩果酸峰高变异系数rsd = 1.40%，可见供试品溶液在8 h内稳定。

2．7 加样回收率试验

采用加样回收法，取已知含量（熊果酸 7.72 mg/g、齐墩果酸1.83 mg/g）的本品，精密称定5份，每份约0.23 g ，分别精密加入熊果酸1.697 mg，齐墩果酸0.489 mg ，依法测定，回收率分别为98.11%、101.64%，变异系数分别为1.04%、1.42%，表明本方法回收率良好。

2．8 样品的测定

取3个批次的裸花紫珠样品制成供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20 μl于液相色谱仪中，测得齐墩果酸、熊果酸色谱峰高度值，以外标法计算其含量。3批裸花紫珠样品中齐墩果酸与熊果酸含量测定结果见表1。表1 样品测定结果

3 讨论

本试验结果表明裸花紫珠样品中齐墩果酸与熊果酸含量比为1∶3～4，含量分别约占药材的0.1%～0.2%和0.4%～0.8%，含量的不同与采收季节有关，其中1、2号样品为夏季采收，3号样品为秋季采收，提示本品秋季采收齐墩果酸与熊果酸含量高。

本试验所测齐墩果酸与熊果酸为抗菌、消炎、护肝降酶的活性成分，测定两者的含量对控制本品质量有实际意义，但2种物质相同分子的异构体，化学性质相似，达到基线分离难度很大。经系统适用性研究，上述条件下两者基本达到分离，分离度1.49，但尚未完全达到基线分离，由于2种成分的色谱峰为正常峰，适用以峰高计算含量。经试验以峰高计算2种成分含量重精密度较好，变异系数均小于1.8%，而以峰面积测定则精密度均较差，变异系数大于2.5%，故本试验测定齐墩果酸与熊果酸两种成分的含量，以峰高计算更为准确可靠。

从诸多文献及中国药典记载，对熊果酸的提取多用乙醚，乙醚对熊果酸属于微溶，所以要进行多次提取才能提取完全，而且，由于裸花紫珠的用药部位为植物的叶，叶背密被厚厚的绒毛，质轻，直接用乙醚提取，药材浮在液面上，不利提取，并且提取液与药材不能自然分离，需要过滤，乙醚挥散快，也需要反复洗，更加大了乙醚的用量，不经济；因此改用乙醇先行回溜提取，就可以克服上述不足；乙醇提取物挥干溶剂后，以石油醚洗涤，除去脂溶性色素杂质，以减少对色谱柱的污染；经对石油醚提取液进行薄层色谱检测，齐墩果酸与熊果酸的均呈阴性反应。

【参考文献】

1 王祝年，韩壮.裸花紫珠的化学成分的研究［j］.热带亚热带植物学报，2007，（4）：359