HPLC法测定广藿香中齐墩果酸和熊果酸的含量

摘要：采用超声技术提取广藿香中齐墩果酸和熊果酸，以薄层层析色谱法对齐墩果酸和熊果酸进行定性分析，以高效液相色谱法进行定量分析，液相条件为：色谱柱为Ｃ１８柱（２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ，５ μｍ），流动相为乙腈－甲醇－０．３％Ｈ３ＰＯ４水溶液（６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ），流速０．８ ｍＬ／ｍｉｎ，检测波长２１０ ｎｍ，柱温２８℃。结果表明，齐墩果酸和熊果酸的浓度与峰面积呈良好的线性关系，其线性范围分别为０．０２０ ５～０．４１０ ４ μｇ（Ｒ＝０．９９９ ４）和０．０２０ ７～０．４１４ ４ μｇ（Ｒ＝０．９９９ ０）， 样品中两者的平均回收率分别为９７．５３％和９８．５５％，ＲＳＤ分别为１．４％和１．６％，测得样品中齐墩果酸和熊果酸的含量分别为０．１０３ ｍｇ／ｇ和０．１６９ ｍｇ／ｇ。

关键词：广藿香；齐墩果酸；熊果酸；薄层色谱法；高效液相色谱法

中图分类号：Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）10－2111-03

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｅａｎｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｕｒｓｏｌｉｃ Ａｃｉｄ ｉｎ Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ ｂｙ ＨＰＬＣ

ＳＵＮ Ｒｅｎ－ｓｈｕａｎｇ１，ＭＥＮＧ Ｊｕｎ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔｏｎｇｈｕａ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｔｏｎｇｈｕａ １３４００２， Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｔｏｎｇｈｕａ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ， Ｔｏｎｇｈｕａ １３４０００， Ｊｉｌｉｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ． ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ by ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｅｄ ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｂｙ ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＴＬＣ）． Ｔｈｅ ｔｗｏ ａｃｉｄs ｗｅｒｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ （２５０ ｍｍ×４．６ ｍｍ， ５ μｍ） ｗｉｔｈ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．３％ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｃｉｄ （６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ） ａｔ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ and ２８℃， ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ２１０ ｎｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｌｉｎｅａｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０２０ ５～０．４１０ ４ μｇ （Ｒ＝０．９９９ ４） ａｎｄ ０．０２０ ７～０．４１４ ４ μｇ（Ｒ＝０．９９９ ０） ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ recoveries ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ９７．５３％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ １．４％ ａｎｄ ９８．５５％ ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ １．６％； ０．１０３ ｍｇ／ｇ ｏｆ ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ０．１６９ ｍｇ／ｇ ｏｆ ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ in the sample．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ （Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．； ｏｌｅａｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ｕｒｓｏｌｉｃ ａｃｉｄ； ＴＬＣ； ＨＰＬＣ

广藿香为唇形科植物广藿香Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ （Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．的干燥地上部分［１］。目前普遍认为广藿香主要有效成分存在于其挥发油中，但也有研究表明，广藿香全草中的山楂酸、齐墩果酸和熊果酸等三萜类化合物同样具有生理活性［２，３］。熊果酸与齐墩果酸为同分异构体，是植物的次生代谢产物，其中熊果酸具有显著降低谷丙转氨酶、增进食欲和恢复肝功能的作用；而齐墩果酸可消黄疸、对急慢性肝炎具有一定功效。目前，已有对熊果酸与齐墩果酸进行定量分析的报道［4］。该项研究采用薄层层析色谱（Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）进行了定性分析，并用高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）同时测定了广藿香中熊果酸和齐墩果酸的含量。这将为广藿香的质量控制及综合开发利用提供试验依据。

１材料与方法

１．１试剂与材料

齐墩果酸和熊果酸（供含量测定用，批号分别为１１０７０９－２００３０４、１１０７４２－２００５１６，中国药品生物制品检定所）；乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水，碘为化学纯，其余试剂为分析纯，硅胶Ｇ薄层预制板（１０ ｃｍ×２０ ｃｍ）购至青岛海洋化工厂。

广藿香采自高要市莲塘镇，经通化师范学院于俊林教授鉴定为唇形科刺蕊草属植物广藿香Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ（Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ．。仪器主要有高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），ＫＱ－２０００ＫＤＢ型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

１．2薄层分析法分析广藿香

１．2．１标准溶液的制备精密称取标准品齐墩果酸５．１３０ ｍｇ和熊果酸５．１８０ ｍｇ，分别用甲醇定容至25 ｍL，配成齐墩果酸和熊果酸标准溶液，齐墩果酸的浓度为０．２０５ ２ ｍｇ／ｍＬ，熊果酸的浓度为０．２０７ ２ ｍｇ／ｍＬ。

１．2．２供试品溶液的制备精密称取广藿香药材粉末１.00 ｇ，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇２０ ｍＬ，超声处理６０ ｍｉｎ，过滤，收集滤液，剩余残渣重复用１０ ｍＬ甲醇洗涤2次，收集洗涤液后，定容至50 ｍＬ，待用。

１．2．３薄层预处理和分离分别吸取齐墩果酸、熊果酸标准品溶液和供试品溶液，点样于同一硅胶Ｇ薄层板上。将薄层板点样的一端浸入１％（m/V）碘－二氯甲烷溶液中约１２～１５ ｍｍ，使溶液没过斑点后迅速取出，立即覆以一玻璃板，３０ ｍｉｎ后取下玻璃板，热风吹２～３ ｍｉｎ。再以环己烷－二氯甲烷－乙酸乙酯－冰醋酸（２０∶５∶８∶０．１，Ｖ／Ｖ）为展开剂，展开，取出，晾干，喷１０％（Ｖ／Ｖ）硫酸乙醇溶液，于１０５℃加热至斑点显色清晰［４］。

１．3广藿香中齐墩果酸和熊果酸的含量测定

１．3．１标准溶液与供试品溶液的制备精密吸取经ＴＬＣ鉴别后的齐墩果酸和熊果酸标准溶液各１ ｍＬ，加入１０％（Ｖ／Ｖ）甲醇定容至１０ ｍＬ，制成含２０．５ μｇ/ｍＬ的齐墩果酸和２０．７ μｇ/ｍＬ的熊果酸混合标准溶液。供试品溶液的制备同１．2．２。

１．3．２色谱条件Ｃ１８柱（４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ）；流动相：乙腈－甲醇－０．３％Ｈ３ＰＯ４水溶液（６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ）；流速为０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２１０ ｎｍ；柱温为室温；外标法定量分析［５］。熊果酸和齐墩果酸峰分离度为１．５４，理论塔板数分别为１６ ４６９和１６ ９２１。

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２结果与分析

２．１ＴＬＣ结果分析

ＴＬＣ结果见图１，样品与齐墩果酸和熊果酸标准品在相同位置上显相同的紫色斑点，可知广藿香样品中含有齐墩果酸和熊果酸。

２．２广藿香中齐墩果酸和熊果酸含量的测定

２．２．１线性关系的考察精密吸取齐墩果酸和熊果酸混合标准品１、５、１０、１５和２０ μＬ分别进样，按上述色谱条件平行测定３次，以标准进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得齐墩果酸回归方程为＝６９０．４１－２．３０５ ９，Ｒ＝０．９９９ ４；熊果酸回归方程为＝５６２．４２＋４．５３５ ５，Ｒ＝０．９９９ ０，表明当齐墩果酸进样量在０．０２０ ５～０．４１０ ４ μｇ之间，熊果酸进样量在０．０２０ ７～０．４１４ ４ μｇ之间时，呈良好线性关系［６］。

２．２．２精密度试验精密吸取熊果酸和齐墩果酸的混合标准液１０ μＬ，平行进样５次，在２．２．１条件下，测得熊果酸峰面积的相对标准偏差（ＲＳＤ）为０．９％（ｎ＝５），齐墩果酸峰面积ＲＳＤ为０．６％（ｎ＝５），说明仪器精密度符合要求。

２．２．３稳定性试验精密吸取同一份供试品溶液，分别于０ ｈ、２ ｈ、４ ｈ、８ ｈ和１２ ｈ后进样１０ μＬ分析，测得峰面积ＲＳＤ值分别为１．５％和１．８％，说明在１２ ｈ内样品稳定性较好。

２．２．４回收率试验取已知含量广藿香药材粉末约０．３０ ｇ，精密称取５份，每份加入标准液１ ｍＬ，测定峰面积，计算回收率，结果样品中齐墩果酸和熊果酸的平均回收率分别为９７．５３％和９８．５５％，ＲＳＤ分别为１．４％和１．６％。

２．２．５样品测定按上述色谱条件对熊果酸和齐墩果酸的标准混合溶液及广藿香供试品液进行分析［７］，结果见图２，结果表明广藿香中齐墩果酸的含量为０．１０３ ｍｇ／ｇ，熊果酸的含量为０．１６９ ｍｇ／ｇ。

３讨论及结论

３．１提取条件的选择

在预试验中，我们以齐墩果酸和熊果酸的含量作为考察指标，筛选并确定最佳提取方法。结果表明，提取剂和提取时间对试验结果影响不大，采用甲醇超声６０ ｍｉｎ提取样品的结果较好［８］。

３．２流动相的选择

齐墩果酸和熊果酸均为五环三萜类同分异构体，在中性流动相中三萜酸可解离，导致该化合物很难分离。验中曾采用甲醇－水不同比例的流动相［９，１０］，分离效果均不理想。流动相中增加适量磷酸可改善峰形，有利于２种三萜酸分离，在反相柱上甲醇的比例增减对两者的分离影响较大，经过反复试验，最终选择乙腈－甲醇－０．３％Ｈ３ＰＯ４水溶液（６０∶３０∶１０，Ｖ／Ｖ）作为流动相，且流动相预先混合的基线较为平稳，能使二者得到良好分离。

试验结果表明，广藿香中含有生理活性物质齐墩果酸和熊果酸，对广藿香中的齐墩果酸和熊果酸进行分离提取和含量测定，可为进一步开发和利用广藿香提供理论依据。

参考文献：

［１］ 国家药典委员会． 中华人民共和国药典（一部）［M］． 北京：化学工业出版社，２００５．

［２］ 关玲，徐丽珍，丛浦珠，等． 广霍香化学成分的研究［Ｊ］． 中国中药杂志，１９９４，１９（６）：３５５-３５７．

［３］ 汤鲁宏． 一种从藿香中同时提取精油、黄酮和三萜类成分的工艺． 中国专利，２００８１０１２３８３６ ［Ｐ］． ２００８－１０－１５．

［４］ 严华，张聿梅，林瑞超． 原位预处理－薄层扫描法同时测定女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量［Ｊ］． 药物分析杂志，２００９，２９（７）：１１０７－１１１０．

［５］ 谢莹，杭太俊，程赞，等． 高效液相色谱法测定中药中齐墩果酸和熊果酸含量［Ｊ］． 中国中药杂志，２００１，２６（９）：６１５－６１６．

［６］ 严华，苏健，王宝． 药材中齐墩果酸与熊果酸质控指标的探究［Ｊ］． 药物分析杂志， ２００９，２９（８）：１４００－１４０６．

［７］ 邹盛勤，陈武． 高效液相色谱－光电二极管阵列检测器法测定野山楂中两组分的含量［Ｊ］． 食品科学，２００６，２７（１１）：４３８－４４０．

［８］ 戚志华，王四旺，王剑波． 不同生长期女贞子中齐墩果酸和熊果酸的含量变化［Ｊ］． 中国中药杂志，２００７，３２（１５）：１５８３－１５８５．

［９］ 石心红，郭江宁，翟静华． ＨＰＬＣ法测定女贞子中齐墩果酸、熊果酸的含量［Ｊ］． 海峡药学， ２００５，７（４）：４１．

［１０］ 李涛，郝武常，徐长根，等． ＨＰＬＣ－ＥＬＳＤ法测定不同产的女贞子中齐墩果酸与熊果酸的含量［Ｊ］．中药材，２００５，２８（５）：３９１．

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文

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