三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的比较

摘要：目的 评价3种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的敏感性和特异性。方法 临床分离的110株葡萄球菌，经过革兰染色，显色培养基显色培养，触酶试验，VITEK32鉴定后，用试管法、玻片法、商品乳胶血凝法（slidex staph-kit），鉴定葡萄球菌和评价凝固酶试验方法。3种方法结果不一致的菌株进行重复试验。用兔血浆试管法作为标准，比较其它凝固酶方法的敏感性、特异性。结果 兔血浆试管法检测到65株阳性菌株，以此为标准，兔血浆玻片法有3株假阳性，人血浆玻片法和乳胶血凝法的假阳性分别为8株和2株。人血浆试管法的鉴定符合率为100%，其余各种方法的敏感性均为100%，而特异性（兔血浆和人血浆玻片法，乳胶凝集试验）分别为95.6%，88%，和98.5%。结论 人血浆凝固酶试管法敏感性特异性均较高，是鉴定葡萄球菌凝固酶试验的好方法，适合于各基层临床实验室对葡萄球菌的鉴定。

关键词：金黄色葡萄球菌；血浆凝固酶；乳胶试剂

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是医院内感染的重要病原菌，然而临床标本中金黄色葡萄球菌鉴定中往往困扰者广大检验工作者，血浆凝固酶试验是鉴定金黄色葡萄球菌的重要方法之一。鉴定的准确性直接关系到进一步上机鉴定及药敏试验判断及MRS纸片法筛选判断。凝固酶分为两种：游离性凝固酶，结合型凝固酶，游离型凝固酶常用试管法鉴定，结合型凝固酶常用玻片法鉴定。随着现代微生物技术的不断发展，许多医院开始选用法国梅里埃公司生产的葡萄球菌乳胶凝集试剂作为检出金黄色葡萄球菌的常规筛选试验试剂，虽然乳胶试剂盒简便，快速，但是易出现假阳性且价格昂贵。为寻找一种适合广大基层医院实验室对葡萄球菌鉴定经济，简便的鉴定方法。本文以兔血浆试管法为标准[1]，对110株临床分离的葡萄球菌凝固酶分别进行兔血浆，人血浆凝固酶试验和乳胶凝集试验。评价其敏感性，特异性。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 110株葡萄球菌均来自于我院2011年12月～2013年9月临床分离菌株，保存于-20℃低温冰箱，实验前接种于5%羊血基础平板，取对数生长期菌落进行试验。

1.1.2菌株鉴定 以上所有菌株都经革兰染色，触酶试验，显色培养基培养，血浆凝固酶试管法和VITEK32微生物自动鉴定。

1.1.3质控菌株 以金黄色葡萄球菌ATCC25923作为阳性对照菌株，表皮葡萄球菌ATCC26069为阴性对照菌株。购于云南省临床检验中心。

1.1.4其它试剂、材料

1.1.4.1兔血浆，上海市疾病控制中心生产商品试剂（批号：20130129）。

1.1.4.2乳胶试剂盒 （slidex staph-kit）法国梅里埃公司生产。

1.1.4.3人血浆制备 取30例外观清亮体检（肝、肾功，血糖、血脂均正常）肝素抗凝血制备成混合血浆低温保存备用。

1.1.4.4其它材料 所用试管、烧杯均洗净后高压灭菌消毒后备用，玻片均用新玻片消毒灭菌后备用。

1.2方法 将葡萄球菌接种于血平板，经过18～24h 培养后，分别采用兔血浆，人血浆，乳胶试剂进行试验。

1.2.1玻片法试验 取1滴生理盐水置玻片上，挑取待测细菌，在生理盐水中制成菌悬液；取血浆1滴置玻片上与菌悬液混匀，10s内见到明显凝块，而生理盐水中无凝集现象者为阳性；试验同时做阳性，阴性对照[2]。

1.2.2试管法试验 混合血浆用生理盐水稀释4倍，取0.5ml加被鉴定葡萄球菌数个菌落，混合后放35℃孵箱，3～4h记录结果，若阴性，然后再放置24h，再观察记录结果。观察时，将试管从垂直位缓慢倾斜90°，观察试管中凝集的形成。同时做阴性、阳性对照。

1.2.3胶凝集试验 先将致敏的乳胶颗粒试剂充分混匀，在一次性卡片的两个不同区域各加1滴致敏试剂，然后用接种环挑取待测的葡萄球菌的新鲜培养物加入试验区，对照区则加1滴对照试剂，轻轻混匀、乳化，观察结果。30s内，试验侧凝集，而对照侧无凝集时，可判断为阳性。试验同时做阳性、阴性对照。其他所有操作方法均按《全国临床检验操作规程》[3]执行。

2 结果

2.1三种方法检测葡萄球菌的结果见表1。

2.2 以兔血浆试管法为标准，比较其它试验方法的敏感性和特异性（见表2）。

2.3从以上可知3种方法检出凝固酶阳性的葡萄球菌除人血浆玻片法检出率较高外66.4%，其它方法的检出率均无太大差异。兔血浆试管法检测到65株阳性菌株，以此为标准，兔血浆玻片法有3株假阳性，人血浆玻片法和乳胶血凝法的假阳性分别为8株和2株。人血浆试管法的鉴定符合率为100%，其余各种方法的敏感性均为100%，而特异性（兔血浆和人血浆玻片法，乳胶凝集试验）分别为95.6%，88%，和98.5%。

3 讨论

金黄色葡萄球菌是常见的致病菌，正确鉴定金黄色葡萄球菌较为重要。血浆凝固酶试验是检测金黄色葡萄球菌的关键。致病性较强的金黄色葡萄球菌可产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着于细菌表面成块，凝块包绕细菌，使其免遭抗生素，抗体，吞噬等多种因素的作用。葡萄球菌有两种凝固酶，一种是与细菌细胞壁结合的凝固酶，即凝集因子，它可直接作用于纤维蛋白原，可用玻片法检出；另外一种是菌体释放到培养基中的游离凝固酶，它可以与血浆中的凝固酶反应因子协同作用于纤维蛋白原，使血浆凝固，故可用试管法检出。凝集因子试验和血浆凝固酶试验是两个不相关试验，两者不能相互代替，也不可以相互印证。

本次试验可以看出除血浆凝固酶试管法没有假阳性外，其它方法都存在假阳性。血浆凝固酶玻片放的假阳性明显较高（兔血浆68例，人血浆73例），其特异性较差。原因可能是由于人血浆中产生的自身抗体或血浆中的抗凝剂所致。所以在玻片法检测结合型凝固酶时，应注意用蒸馏水代替生理盐水稀释血浆，因为葡萄球菌对盐敏感，特别是不能使用高盐培养基，血浆不能过多，一般是1滴，1接种环血浆，4接种环蒸馏水混匀，可减少假阳性的出现。

乳胶凝集试验中也存在着假阳性，可能是因为金黄色葡萄球菌细胞壁中的蛋白A含量过高而导致假阳性的出现[4]。乳胶凝集试验是用提纯IgG的FC段与金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）结合，反应机制是双链式，所以避免了某些金黄色葡萄球菌游离凝固酶或SPA产生足主所致的假阴性；它用于检测凝集因子和蛋白质A的乳胶混合血浆试剂，大大地提高了检测凝集因子的特异性。

而此次试验中试管法检测葡萄球菌凝固酶的敏感性与特异性均较高，并且人血浆与兔血浆所检出凝固酶阳性葡萄球菌菌株符合率为100%，无假阳性与假阴性出现。主要是由于试管法检测的是游离型凝固酶，是菌体释放到培养基中的，它可以与血浆中的凝固酶反应因子协同作用于纤维蛋白原使血浆凝固，但是试验中血浆应做4倍稀释，结果观察应在35℃温育24h后。

从此次试验可知，在快速鉴定葡萄球菌时，应选用兔血浆作玻片法凝固酶试验或选用乳胶试剂做鉴定，但不能作为确证试验。人血浆凝固酶试管法敏感性特异性均较高，是鉴定葡萄球菌凝固酶试验的好方法，适合于各基层临床实验室对葡萄球菌的鉴定。

参考文献：

[1]张红升.三种鉴定葡萄球菌凝固酶方法的评价[A].实用医技杂志，2007，1（2）：256-257.

[2]高屹.如何做好葡萄球菌凝集因子试验[J].中华医学检验杂志，1999，22（增刊）：43.

[3]叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程[M].2版.南京：东南大学出版社，1992：182-183.

[4]李少茵，刘赐敏，金黄色葡萄球菌鉴定影响因素的研究[J].现代预防医学，2006，33（6）：993-994.