己酮可可碱对内毒素诱导大鼠急性肺损伤的干预作用

【摘要】 目的： 观察己酮可可碱(PTX)对内毒素(LPS)诱导急性肺损伤(ALI)大鼠模型各项病理生理和生化指标的影响，探讨PTX对ALI的干预阻断作用. 方法： 将72只月龄和体质量相近的雄性SD大鼠随机分为3组：对照组(NS组)，实验组(LPS组)，治疗组(PTX组)，每组24只. 给予对照组大鼠尾静脉注射生理盐水，实验组大鼠尾静脉内注射LPS 4 mg/kg，治疗组大鼠尾静脉注射LPS前1 h，由腹腔注射0.036 mol/L PTX 10 mg/kg. 确认实验组复制ALI模型成功之后，即刻给予PTX 10 mg/kg腹腔注射，间隔1 h重复给药，连续5次；其余两组大鼠与实验组同样时间间隔给予腹腔注射等容积的生理盐水. 测定各组动脉血氧分压(PaO2)，pH值，二氧化碳分压(PaCO2)，肺系数，肺水含量，肺通透性指数，检测支气管肺泡灌洗液中性白细胞及巨噬细胞比例，检测丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)，一氧化氮(NO)，诱生性一氧化氮合成酶(iNOS)含量，并进行肺组织大体，病理形态学观察. 结果： 治疗组与实验组相比，PaO2和pH值升高，PaCO2降低，肺系数(0.59±0.17 vs 0.92±0.11, P<0.05)，肺含水量(84.46±0.39 vs 80.22±0.37, P<0.05)，肺通透性指数(7.28±0.54 vs 12.32±0.28, P<0.05)均有明显下降；肺泡灌洗液中性粒白细胞比例下降，肺通透指数减低，NO，iNOS明显下降，SOD水平显著升高(P<0.05). 病理学观察治疗组肺组织病变较实验组为轻. 结论： PTX对LPS诱导ALI大鼠模型具有保护作用，其机制可能与PTX改善能量代谢及减少局部细胞毒性物质有关. PTX对由LPS诱导的ALI具有一定保护作用.

【关键词】 急性病；肺/损伤；己酮可可碱；丙二醛；超氧化物歧化酶；一氧化氮；一氧化氮合酶

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)/急性呼吸窘迫综合征(acute respirator distress syndrome, ARDS)是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)在肺部的局部体现［1］. 己酮可可碱(Pentoxifylline, PTX)作为血管活性药物已用于治疗血管功能不全性疾病，近年的研究还发现PTX具有抑制中性粒细胞、单核细胞聚集，保护血管内皮细胞的作用而将其用于炎症性疾病的治疗，但具体机制尚未阐明［2-3］. 我们采用在鼠尾静脉注射内毒素(lipopolysaccharide, LPS)的方法复制大鼠ALI模型，通过观察PTX对ALI 大鼠模型病理生理以及生化等项指标的影响，旨在进一步探讨PTX对ALI的防治作用及可能的机制.

1材料和方法

1.1材料

SD大鼠72只，体质量250～300 g(河南省动物实验中心提供)；PTX，LPS，甲苯?Triton X?100闪烁液(美国Sigma公司)；超氧化物歧化酶（SOD）, 丙二醛（MDA）, 一氧化碳（NO）及诱生性一氧化氮合成酶（iNOS）检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；BP?211D型电子天平(德国Sartorius公司)；MPF?4型荧光分光光度计，液体闪烁计数仪(日本日立公司)；752 型紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)；便携式ABL?500血气分析仪(丹麦雷度公司)；胰蛋白酶，牛血清白蛋白，DMEM高糖培养基，小牛血清及马血清(美国Gibco公司).

1.2方法

1.2.1模型建立与动物分组

按文献［2］的方法建立大鼠模型. 将大鼠随机分为3组：对照组，实验组和治疗组，每组动物24只. 采用盐酸氯胺酮50 mg/kg腹腔注射麻醉，给予对照组大鼠尾静脉注射生理盐水，实验组大鼠尾静脉注射LPS，剂量为4 mg/kg，治疗组大鼠尾静脉在注射LPS前1 h由腹腔注射0.036 mol/L PTX 10 mg/kg. 确认实验组复制ALI模型成功之后，即刻给予PTX 10 mg/kg腹腔注射，间隔1 h重复给药，连续5次；其余两组大鼠与实验组同样时间间隔给予腹腔注射等容积的生理盐水.

1.2.2血气及肺水肿参数测定

注射LPS 6 h后，放血活杀动物之前，经由左心室采血3 mL，2 mL用于便携式血气分析仪做血气分析，其余1 mL血液分离血清后置-20℃冰箱冷冻待测定. 活杀动物快速肺组织取材，常规包埋，切片进行HE染色. 取材完毕，切开大鼠气管，经气管插入12号针头行肺泡灌洗，每次1 mL，总量为5 mL，记录收集的肺泡灌洗液量，并于显微镜下计数肺泡灌洗液中细胞总数及中性粒细胞，巨噬细胞数并计算所占百分比. 测定各组动脉血气指标、肺系数、肺含水量、肺通透性指数；蛋白含量测定按Lowry法进行，使用752型分光光度计比色(波长700 nm)，将各样品A值与标准曲线对比后，计算蛋白含量并以大鼠肺泡灌洗液上清液蛋白含量比血浆蛋白含量得到肺通透指数(lung penetration index, LPI) .

1.2.3血液及组织中NO, iNOS, SOD, MDA的测定

大鼠血中NO含量测定按试剂操作说明书进行. 注射LPS 6 h后迅速处死大鼠，取出一定量的肺组织，约2 mm×2 mm×2 mm体积大小组织，按15%(W/V)比例加入预冷的Buffer A，在冰浴中匀浆器匀浆，4℃，20 000 g离心30 min，收集上清液即为NOS提取液，置-20℃保存. 采用Lowry法测定iNOS提取液蛋白含量. SOD，MDA检测按试剂盒操作说明书进行.

统计学处理： 测定结果以x±s表示，应用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，组间比较采用方差齐性检验、单因素方差分析(One?way ANOVA)，数据组间多重比较采用LSDt检验. 显著性水准α定为0.05.

2结果

2.1大鼠急性肺损伤模型评价

SD大鼠静脉注射LPS后，可见大鼠呼吸加快，常规肺组织大体切片显微镜观察结果显示符合ALI的诊断标准［3］，表明模型制作成功，可用于实验研究（图1）.

2.2PTX对大鼠血清各项血气指标以及巨噬细胞的影响检测结果显示，与对照组相比，实验组动脉血氧分压(PaO2)，pH值明显下降，二氧化碳分压(PaCO2)明显升高(P<0.01)；与实验组相比治疗组PaO2，pH值升高，PaCO2降低(P<0.05)；治疗组与对照组相比，PaO2，PaCO2和pH值则无明显变化. 治疗组肺泡灌洗液中的中性粒细胞及巨噬细胞比例相对实验组则明显下降(P<0.05，表1). 表1各项血气指标和肺泡灌洗液中巨噬细胞的变化(略)

2.3PTX对大鼠肺水肿的影响与对照组相比，实验组大鼠肺系数、肺水含LPI明显升高；治疗组与实验组相比肺系数、肺水含量、LPI下降，与对照组接近(表2).表2各组大鼠肺水肿参数的变化比较(略)

2.4PTX对大鼠肺组织中SOD活性，MDA含量的影响

与对照组相比，治疗组肺组织中SOD活性降低，MDA含量增加，且差异具有统计学意义(P<0.05)；与实验组相比，治疗组肺组织中SOD活性增加，MDA含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05，表3). 表3PTX对大鼠脑组织中 SOD, MDA, iNOS 和 NO 的影响(略)

2.5PTX对大鼠肺组织中iNOS活性，NO含量的影响

与对照组相比，治疗组肺组织中iNOS活性降低，NO含量增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与实验组相比，治疗组脑组织中iNOS活性增加，NO含量降低，差异具有统计学意义(P<0.05，表3).

2.6PTX对大鼠肺组织形态学的影响

注射LPS后大鼠肺血管内巳有中性粒细胞滞留、聚集. 随时间延长，滞留、聚集现象更加明显，并有向毛细血管外移行增多趋势. 1 h后，肺组织水肿，肺泡隔稍增厚，有少量血液成分渗出，肺泡内有中性粒细胞渗出. 2 h后，肺泡内渗出增多，主要是血浆蛋白形成透明膜，肺泡隔增厚，内有中性粒细胞及红细胞渗出. 治疗组大体标本观察到肺脏充血、水肿减轻，普通显微镜下可见肺血管内中性粒细胞滞留减少，肺充血及肺间质水肿减轻.

3讨论

ALI/ARDS的实质是严重感染或创伤激活肺泡内巨噬细胞和中性粒细胞所引发强烈与失控的全身炎症反应在肺组织的局部体现. TNF?α, IL?8等炎症介质被认为是感染性ALI或者ARDS发病中较为重要的细胞因子［4-5］，目前国内外大多数关于PTX和ALI/ARDS的研究工作主要集中在炎症介质和炎症反应综合症方面［3］. PTX对于MDA, SOD 以及iNOS和NO含量的影响可以从一个侧面综合反映在ALI/ARDS发病过程中，PTX对于氧自由基损伤结果的干预和影响的作用，而有关该方面的研究则少见报道.

氧自由基损伤和ATP依赖性Na+/K+-ATP泵功能受损以及随之而来的钙超载可以激活Ca2+依赖性NOS，从而合成NO增多. 正常生理条件下，肺血管内皮细胞iNOS基因表达量低，而在IL?1，TNF等炎症介质刺激下iNOS表达上调. 本研究结果显示，PTX除具有降低中性粒细胞和巨噬细胞的粘附，减少肺内中性粒细胞和巨噬细胞的聚集之外，还可以抑制血管内皮细胞NOS基因的表达，使得iNOS产生减少，导致产生和释放NO，MDA减少以及SOD的增多，有效阻断和干预肺损伤的形成和继续发展.

应用PTX可以明显减轻由肺组织毛细血管和上皮细胞的通透性增高所导致的肺组织水肿，对LPS所导致ALI表现出明显的改善作用有可能是通过改善肺组织的微循环和微代谢环境，通过削除过多的自由基对肺组织细胞的过氧化损伤发挥作用的，此结论与报道的研究结果基本一致［6，4］. 其作用可能与PTX阻断单核细胞、中性粒细胞的激活，预防和防止肺损伤的发生和发展，使肺组织微循环改善，从而使得能量代谢得以恢复，并使局部对肺组织的有害物质释放减少和活化受抑等因素有关. 但对于ALI/ARDS发病过程中PTX对于自由基的具体影响机制以及PTX的长期疗效等，则有待更深入的实验研究.

【参考文献】

［1］何新华，李春盛，桂陪春，等. 己酮可可碱保护内毒素诱导急性肺损伤的实验研究［J］. 中国急救医学, 2000, 20(10):573-575.

［2］张静，翟介明，潘珏，等. 内毒素耐受大鼠与正常大鼠急性损伤反应比较［J］. 中国呼吸与危重监护杂志, 2003,2(2): 346-350.

［3］中华医学会呼吸病学分会. 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的诊断标准(草案) ［J］. 中华结核和呼吸杂志, 2000,23(4): 203-205.

［4］张永，程德云，王慧，等. 慢性阻塞性疾病大鼠肺内白细胞介素?8和肿瘤坏死因子?α与气道炎症的关系研究［J］. 中国呼吸与危重监护杂志, 2003,2(2): 355-359.

［5］Bauer TT, Monton C, Torres A, et al. Comparison of systemic cytokine levels in patients with acute respiratory distress syndrome, severe pneumonia, and controls ［J］. Thorax, 2000,55(1):46-52.

［6］单丽红，朱玲，蔡政, 等. 己酮可可碱对新生大鼠缺血缺痒性脑病的干预作用［J］. 河南科技大学学报(医学版), 2006,12(24):241-245.