8种含碳酸盐的矿物类中药近红外定性定量模型的建立

[摘要]该研究探索应用近红外光谱技术对8种含碳酸盐的矿物类中药进行快速鉴别。利用OPUS软件中聚类分析法建立的定性分析模型，可以准确鉴别8种含碳酸盐的矿物类中药。另外，使用偏最小二乘法对其中7种矿物类中药的主要成分碳酸钙含量建立近红外定量分析模型，以EDTA滴定法测定值为参照，当碳酸钙含量为47.61%～99.17%时，预测结果的平均相对偏差为0.24%，平均回收率为100.3%。 结果表明，该近红外光谱分析模型可以快速准确鉴别8种含碳酸盐类矿物类中药，对其中7种矿物类中药中碳酸钙的含量也可以快速测定，结果准确、可靠。

[关键词]近红外光谱法；碳酸盐；矿物类中药；聚类分析；碳酸钙；含量测定

[收稿日期]2013-09-11

[基金项目]武汉市2012年高新技术产业发展行动计划生物技术与新医药专项（201260523193）

[通信作者]*陈科力，教授， Tel：（027）68890106，E-mail：

[作者简介]袁明洋，硕士研究生，E-mail：

含碳酸盐的矿物类中药材在矿物类中药中种类较多，在临床应用中发挥了重要作用。如鱼脑石具有化石、通淋、消炎之功效，对石淋、小便不利、中耳炎、鼻炎等病症，有很好的疗效[1]；石燕在临床上可用于治疗淋病、小便不通、带下、尿血、肠风痔漏、眼目障翳等[2]。另有文献报道[2-3]，石燕中含有的钙能减低毛细血管的透过性，对渗出、炎症、水肿等有防治的效果；钟乳石中的钙，很可能是制酸止血的有效成分之一。目前，对碳酸盐类矿物药的鉴定仅局限在性状及一般理化鉴别反应，性状鉴别主观性较强，且无法区分各种矿物类中药的粉末，而一般理化鉴别反应的专属性差，且都含有碳酸盐类，难以区别开。碳酸钙是多种碳酸盐类矿物药的主要成分和有效成分，其常用的含量测定方法为EDTA滴定法，但此方法存在操作繁琐、分析时间较长，不利于药材质量的快速检测。因此，建立一种既能客观、准确、快速鉴别各种含碳酸盐的矿物类中药，又能快速准确检测出其主要成分碳酸钙含量的方法，是有意义的。

近红外光谱技术是近年来迅速发展的一种分析技术，具有快速、高效、无污染、不消耗试剂、操作简便以及实时在线分析等优点[4]，近年来近红外光谱技术在中药领域已有多方面的报道[5-9]。本研究尝试利用近红外光谱技术建立含碳酸盐的矿物类中药的定性鉴别模型，以建立对8种碳酸盐类矿物药的快速鉴别方法；同时对主要成分为碳酸钙的7种矿物类中药材建立近红外定量分析模型，使其对7种矿物药中的碳酸钙的含量可以快速测定，与EDTA滴定法测定结果相比，二者基本一致。

1材料

Matrix-F型近红外光谱仪（德国Bruker公司），配有光纤探头测样附件，铟镓砷检测器及OPUS 5.0光谱分析软件。1/1万分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）。

乙二胺四乙酸二钠、稀盐酸、氢氧化钾、氢氧化钠、钙黄绿素、甲基红、铬黑T、氨水、氯化铵等均为分析纯；基准氧化锌（批号 20100928）。

8种碳酸盐类矿物药样品共38批次，其中寒水石3批次，炉甘石4批次，石花5批次，石蟹2批次，石燕5批次，钟乳石6批次，鱼脑石8批次，鹅管石5批次。将上述样品随机分为训练集样品和验证集样品，每种矿物药的训练集样品数要大于验证集样品数，训练集样品25批次，验证集样品13批次，见表1。每批次样品经湖北中医药大学生药教研室陈科力教授依据性状特征进行鉴定。

表1样品信息

Table 1Information of samples

No.样品名称来源1石花河北安国2石花安徽亳州3石花湖北武汉4钟乳石河北安国5钟乳石河北安国6钟乳石湖北武汉7钟乳石湖北武汉8鱼脑石安徽亳州9鱼脑石安徽亳州10鱼脑石湖北武汉11鱼脑石江西樟树12鱼脑石江西樟树13南寒水石湖北武汉14南寒水石湖北武汉15石蟹河北安国16石蟹河南禹州17石燕河北安国18石燕湖南岳阳19石燕江西樟树20鹅管石安徽亳州21鹅管石湖南岳阳22鹅管石江西樟树23炉甘石安徽亳州24炉甘石湖北武汉25炉甘石河南禹州26石花安徽亳州27石花河南禹州28钟乳石安徽亳州29钟乳石湖北武汉30鱼脑石河北安国31鱼脑石河北安国32鱼脑石江西樟树33南寒水石安徽亳州34石燕河南禹州35石燕江西樟树36鹅管石河北安国37鹅管石湖北武汉38炉甘石湖北武汉注：1～25. 训练集样品；26～38. 验证集样品。

2方法与结果

2.1采集参数

扫描波数间隔8 cm-1，扫描累积次数32次，扫描区间12 000～4 000 cm-1，InGaAs检测器，光纤传导。

2.2采集方法

取各种药材样品，粉碎过200 目筛，称取适量样品置于样品杯中，压实，按采集参数随机对各种样品进行近红外光谱采集，以上所有样品重复测定6 次，取平均光谱作为该样品的近红外光谱。

2.3定性模型的建立

2.3.1建模谱段的选择将训练集样品重复采集的6张光谱的平均光谱建立定性模型，验证集样品不参与建模，只用于对模型的验证。训练集样品的近红外平均光谱见图1，在全谱范围内，谱段7 350～6 500，6 070～5 000，4 800～4 050 cm-1存在较大差异，故考虑选用此3个谱段为建模的待选谱段。为了选择合适的建模谱段，试验用上述3个谱段任意组合建立定性模型，以同种药材的全部近红外光谱聚为一类，且与他种药材相区别，视为此种药材被唯一识别，结果发现，谱段6 070～5 000 cm-1与4 800～4 050 cm-1组合，建立的定性模型可以使每种药材被唯一识别。近红外建模谱段的选择见表2。

图18种含碳酸盐的矿物类中药近红外光谱图

Fig.1Near-infrared spectra of 8 kinds carbonate-containing mineral Chinese medicines

表2建模谱段的选择

Table 2Spectral selection

建模谱段/cm-1模型鉴别结果7 350～6 500鱼脑石唯一识别6 070～5 000钟乳石、南寒水石唯一识别4 800～4 150除鱼脑石、鹅管石外其他品种均唯一识别7 350～6 500，6 070～5 000南寒水石、钟乳石唯一鉴别6 070～5 000，4 800～4 150所有品种均唯一鉴别7 350～6 500，4 800～4 150炉甘石、石燕、石蟹、石花唯一鉴别7 350～6 500，6 070～5 000，4 800～4 150除钟乳石、鹅管石外其他品种均唯一鉴别

2.3.2预处理方法的选择近红外光谱除包含样品自身信息外，还包括了其他无关信息和噪声，如电噪声、样品背景和杂散光等[10]。因此，在建立模型时，消除光谱数据无关信息和噪声变得十分关键。矢量归一化法可校正光纤路径长度潜在变异、光源强度波动以及人为因素的影响[11]，所以为了保证模型的准确性与适用性，采用矢量归一化方法对图谱进行预处理是必要的。一阶导数和或二阶导数是校正基线的常用方法，可分别消除基线的偏移与漂移造成的影响，提高光谱分辨率；一阶导数还可减少由于样品表面物理性质及光纤采样点位置引起的光谱图变化[12]；而由于颜色引起的光谱漂移可用二阶导数法消除[13]。试验对光谱数据预处理方法进行了考察，结果见表3，通过试验发现选择矢量归一化法组合一阶导数光谱数据预处理方法，建立的模型可以对建模品种实现唯一鉴别。在预处理方法中，一阶导数或二阶导数被选择时，同时还包含平滑点的选择，平滑可以消除误差改进数据，但是平滑点数过多，会使数据失真，故试验选择5点平滑。

表3预处理方法的选择

Table 3The choice of pretreatment method

图谱预处理预处理方法平滑点数鉴别结果无处理-石燕唯一鉴别矢量归一化-石蟹、炉甘石、石燕、南寒水石唯一鉴别一阶导数5，9石蟹、石燕唯一鉴别一阶导数+矢量归一化5，9所有品种矿物药均唯一鉴别二阶导数5，9石燕、鱼脑石唯一鉴别二阶导数+矢量归一化5，9石花、石蟹、石燕唯一鉴别

2.3.3定型模型的建立及验证本文采用欧式距离法计算样本间的相似程度，通过与马氏距离法聚类的效果相比较，发现对于少量样品，选择欧氏距离法聚类的稳定性更好[14]。通过对特征谱段的选择及预处理方法不断优化，试验所建立的定性模型对8 种碳酸盐类矿物药可以很好的鉴别，具体建模参数见表4，训练集样品聚类分析结果见图2。将验证集的13 批样品的近红外平均光谱调入模型中，验证模型的准确性，结果发现，13 批样品均能正确的聚类，模型的预测正确率为100%。

2.4EDTA滴定法对碳酸盐类矿物药中碳酸钙的含量测定

2.4.1EDTA标准溶液的配置称取乙二胺四乙酸二钠约19 g，加适量水使溶解至1 000 mL，如果溶液混浊，则应该过滤。然后转移至广口瓶中，摇匀，贴上标签。

表4近红外光谱定性模型建模参数

Table 4Parameters of near-infrared qualitative models

建模条件参数光谱预处理方法一阶导数+矢量归一化（5点平滑）谱段范围6 070～5 000，4 800～4 050 cm-1算法Ward′s algorithm（标准算法）

图2训练集中8种样品的聚类分析图

Fig.2Cluster analysis diagram of 8 kinds of samples in training set

2.4.2EDTA标准溶液的标定取于800 ℃灼烧至恒重的基准氧化锌0.12 g，精密称定，加稀盐酸3 mL使溶解，加水25 mL，加0.025%甲基红的乙醇溶液1 滴，滴加氨试液至溶液显微黄色，加水25 mL与氨-氯化铵缓冲液（pH 10.0）10 mL，再加铬黑T指示剂少量，用配置的乙二胺四乙酸二钠溶液滴定至溶液由紫色变为纯蓝色，重复测定3次，并将滴定的结果用空白试验校正。

2.4.3EDTA滴定法测定碳酸钙含量测定方法如下： 取药材样品细粉约0.2 g，精密称定，置于锥形瓶中，加稀盐酸5 mL，加热使溶解，加水100 mL 与甲基红指示剂1滴，滴加10%氢氧化钾溶液至溶液显黄色，再继续多加10 mL，并加钙黄绿素指示剂约20 mg，用乙二胺四乙酸二钠滴定液滴定至黄绿色荧光消失而显橙色。碳酸钙在0.051 2～0.400 4 g与乙二胺四乙酸二钠滴定量呈良好的线性关系，得回归方程为Y=192.38X+0.695 2（R2=1.000 0）。训练集和验证集样品（其中含碳酸锌的炉甘石除外），每份样品平行测定3 次，取平均值，将EDTA滴定法测定的含量值作为参考值。

2.57种碳酸盐类矿物药近红外定量模型建立与验证

本实验用交互验证法，将34批主要成分为碳酸钙的7种矿物药，按碳酸钙含量大小排序，均匀选择22 份样品作为训练集样品，12份样品作为验证集样品[15]，且训练集样品碳酸钙含量范围要大于验证集样品碳酸钙含量范围。采用PLS算法，利用OPUS/QUANT-2定量分析软件进行数据处理，将训练集的近红外光谱与EDTA滴定法测定的参考值相关联。采用CV（Cross-Validation）和TSV（Test Set Validation）2种验证方法对定量模型进行验证，利用决定系数（R2）、交叉验证均方差（RMSECV）和外部验证均方差（RMSEP）等参数作为模型性能的综合评价指标。其中，R2越接近1，RMSECV越小，表明模型的结构越合理；RMSEP越小表示模型的预测性能越强。

在上述评价方法的基础上，利用OPUS软件中自动优选建模参数功能，选择几组较好的建模参数，并对最好的建模参数进行适当优化，几组优选的建模参数建立的定量模型见表5。综合考虑内部交叉验证结果和外部验证结果，选择模型5作为碳酸钙的定量分析模型效果最好。以碳酸钙的参考值为横坐标，近红外定量模型的预测值为纵坐标，二者的内部交叉验证校正曲线见图4，用建立的碳酸钙定量分析模型对验证集样品的含量进行预测，参考值与预测值的相关曲线见图4。

表5碳酸钙近红外定量模型优选

Table 5The selective of near-infrared quantitative model of calcium carbonate

校正模型建模谱段/cm-1预处理方法内部交叉验证外部验证相关系数R2内部验证均方根RMSECV相关系数R2外部验证均方根RMSEP主成分

维数17 500～4 250FD（9）+MSC0.947 73.340.952 62.25426 100～4 250FD（9）+MSC0.9164.230.971 61.74535 450～4 250FD（9）+MSC0.909 94.380.966 11.9547 500～4 150FD（9）+MSC0.964 62.750.954 62.2457 500～4 150FD（5）+MSC0.966 92.650.957 92.124

采用PLS方法建立多元校正模型，需要确定最佳的主成分数，主成分数对模型的稳定性有很大影响，主成分过多会导致模型“过拟合”，过少则模型出现“欠拟合”[16]，2种现象均会导致模型预测能力下降。本实验以训练集内部交叉验证均方差（RMSECV）为优化参数，RMSECV越小，模型的预测精度越高，当RMSECV最小时，所选主成分最佳。本试验中，当Rank为4时，RMSECV最小， RMSECV与Bank之间的关系见图3。

各种建模参数确定后，所建立的碳酸盐定量模型的相关系数为96.69%，RMSECV为2.65；内部交叉验证结果见表6，内部交叉验证平均相对偏差为2.5%，表明建立的模型性能较好。利用此模型，对验证集中的12 批样品进行定量分析，得到的预测结果见表7。以EDTA滴定法测定值作为参考值，以模型的预测值与参考值的相对偏差来衡量模型的预测能力。预测结果最大相对偏差为0.56%，平均相对偏差为0.24%，平均回收率为100.3%，表明模型的预测效果良好。根据上述训练集内部交叉验证和验证集外部验证结果，发现建立的碳酸盐类矿物药碳酸钙含量的近红外定量分析模型具有一定的适用性，碳酸钙质量分数在47.61%～99.17%，预测能力较好。

图3碳酸钙的RMSECV与Rank值的关系

Fig.3The relationship diagram between RMSECV and Rank value

A.训练集样品；B.验证集样品。

图4碳酸钙预测值与参考值相关图

Fig.4Relationships between reference value and predict value

3讨论

矿物药表面难免会沾有泥土杂质，这些杂质对近红外光谱采集、定性定量模型建立及矿物药碳酸钙含量预测结果等会产生影响。另外，矿物药表面特征变异大，直接在矿物药表面采集光谱，稳定性不好。因此，试验中的样品采集光谱前，首先必须经过净制和粉碎过程，保证每一批次样品所采集的光谱的一致性与代表性。

碳酸盐类矿物中药材在性状鉴别上相对比较容易鉴别，但是药材粉碎后依靠性状鉴别难度很大且费时，又因其主要成分一致，一般理化鉴别也难以区别。本试验建立近红外定性鉴别模型可以准确快速鉴别上述8种碳酸盐类矿物药及其粉末。试验中因建模样品较少，模型的适用性将受到一定的限制，随着样品量的不断增加，后期将不断对模型进行优化，以达到应用的目的。

利用EDTA滴定法测试矿物药中的钙离子含量时，本试验采用了钙黄绿素法，此方法在指示剂的选择性和灵敏度上要优于钙指示剂法。选择的测定方法操作简便，滴定终点灵敏，检测结果可靠，可以作为检测矿物药中药中钙离子含量的方法。

由于采集的样本量有限，试验中建立的碳酸钙定量模型适用范围在47.61%～99.17%，文献报道[17-19]的碳酸盐类矿物药中碳酸钙含量范围几乎在本试验建立的定量模型适用范围内，因此所建立的碳酸钙近红外定量模型具有一定的适用性。在实际应用中根据样本量的增加，可以进一步扩大含量适用范围以满足应用需要。

表6碳酸盐训练集交叉验证结果

Table 6The results of cross validation from carbonate training set%

表7碳酸盐验证集验证结果

Table 7The validation results from carbonate validation set%

[参考文献]

[1]赵婷，高昂，巩江，等.鱼脑石药学研究概况[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（9）：82.

[2]杨美华.石燕的矿物组分及微量元素的分析[J].江西中医学院学报，1997，9（1）：33.

[3]陈国佩，韦绍霞.钟乳石不同炮制品中碳酸钙含量测定[J].中国中医药科技，1996，3（6）：25.

[4]高娟，唐素芳，高立勤，等.浅谈近红外光谱技术在药物分析领域的应用[J].天津药学，2010，22（4）：72.

[5]许麦成.近红外漫反射光谱法快速测定地黄中梓醇含量[J]. 中药材，2011，34（7）：1072.

[6]高鸿彬，刘浩，相秉仁.半夏及其伪品天南星的近红外漫反射快速无损鉴别[J].光谱实验室，2012，29（2）：899.

[7]刘君动，叶正良，李德坤，等.近红外透射光谱法测定丹酚酸提取物中的丹酚酸B[J].光谱实验室，2012，29（2）：1008.

[8]杜敏，巩颖，乔延江，等.样品表面近红外光谱结合多类支持向量机快速鉴别枸杞子产地[J].光谱学与光谱分析，2013，33（5）：1211.

[9]蔡佳良，郭念欣，姬生国，等.运用近红外光谱法建立广藿香中百秋李醇的定量模型[J].中国中药杂志，2012，37（14）：2113.

[10]褚小立，袁洪福，陆婉珍.近红外分析中光谱预处理及波长选择方法进展与应用[J].化学进展，2004，16（4）：528.

[11]Cinier R，Guilment J. Quantitative analysis of resorcinol in aqueous solution by near-infrared spectroscopy[J]. Bruker Report，1998，146：6.

[12]Scafi S H F， Pasquini C. Identification of counterfeit drugs using near-infrared spectroscopy [J].Analyst， 2001，126：2218.

[13]徐广通， 袁洪福， 陆婉珍. 现代近红外光谱技术及应用进展[J].光谱学与光谱分析， 2000，20（2）：134.

[14]刘义梅， 陈科力，袁明洋，等.近红外漫反射光谱法快速鉴别两组化石类中药材[J].世界科学技术――中医药现代化，2013，15（7）：132.

[15]白雁.现代近红外光谱分析技术在药品及食品品质评价系统中的应用[M].北京：高等教育出版社，2009：138.

[16]严衍禄.近红外光谱分析基础与应用[M].北京：中国轻工业出社，2005：175.

[17]胡玉清，赵中杰，江佩芬.中药石燕中碳酸钙和其他化学成分的测定[J].中国药学杂志，1989，24（7）：421.

[18]张晓敏.不同矿物药材重金属，有效成分，浸出物及有机质含量分析[D].西安：西北农林科技大学，2010.

[19]夏振江，魏立新，杜玉枝，等.南寒水石质量标准研究[J].中南药学，2010，8（9）：654.

A NIR qualitative and quantitative model of 8 kinds of

carbonate-containing mineral Chinese medicines

YUAN Ming-yang1， HUANG Bi-sheng1， YU Chi2， LIU Yi-mei1， CHEN Ke-li1*

（1.Key laboratory of Ministry of Education on Traditional Chinese Medicine Resource and

Compound Prescription & Hubei University of Traditional Chinese Medicine， Wuhan 430065， China；

2 .The Xiantao Institute for Drug Control， Xiantao 433000， China）

[Abstract]The aim of this paper is to apply near infrared spectroscopy techniques to construct a rapid identification method for 8 kinds of mineral Chinese Medicines containing carbonates. The qualitative model using clustering analysis method in OPUS software can identify accurately 8 kinds of carbonate-containing mineral Chinese medicines. The near-infrared quantitative model was established by using partial least squares method （PLS） for 7 mineral Chinese Medicines in which main component is calcium carbonate. Compared with the results by EDTA titration， the established quantitative analysis model for calcium carbonate content showed a good prediction result that when the content is between 47.61%-99.17%， the average relative deviation of the prediction result is 0.24% and the average recovery rate was 100.3% . The results also showed that the model using near infrared spectroscopy can get not only a rapid identification of the 8 mineral Chinese medicines containing carbonates， but also an accurate and reliabe content determination of calcium carbonate for the 7 mineral Chinese medicines which contain the component.

[Key word]near-infrared spectroscopy； carbonate； mineral Chinese medicines； cluster analysis； determination

doi：10.4268/cjcmm20140221