TNF?α基因多态性对雷公藤甲素抑制PBMC分泌TNF?α的影响

【摘要】 目的：tnf?α基因多态性对雷公藤甲素刺激pbmc分泌tnf?α的影响。方法：采用等位基因特异引物pcr法对41名健康志愿者tnf?α基因启动子区-308位点基因多态性进行检测，同时进行外周血单个核细胞（pbmc）培养，用脂多糖（lps）或雷公藤甲素刺激培养细胞，收集上清液，elisa法检测上清液中tnf?α的含量。结果：tnf?α -308非g/g纯合子基因型健康志愿者pbmc经lps刺激后tnf?α的分泌量明显较tnf?α -308g/g纯合子高；雷公藤甲素能够抑制tnf?α -308g/g纯合子基因型健康志愿者pbmc分泌tnf?α，而对tnf?α -308非g/g纯合子基因型健康志愿者pbmc没有明显的抑制作用。结论：肿瘤坏死因子基因多态性与雷公藤甲素刺激外周血单个核细胞分泌tnf?α的量存在一定的联系，推测该基因多态性可能与临床雷公藤治疗类风湿关节炎所产生的个体疗效差异有一定关联。

【关键词】 雷公藤甲素 肿瘤坏死因子 外周血单个核细胞 基因多态性

the study of the relation between triptolide inhibits peripheral blood mononuclear cell to secret tnf?α and tumour necrosis factor?α gene polymorphism

chen hong?bo，tu sheng?hao，sheng dong?yun，hu yong?hong.

department of nephrology, tcm hospital of zhejiang province, hangzhou 310006, china

［abstract］ objective:to study the relation between triptolide inhibit peripheral blood mononuclear cell to secret tnf?α and tumour necrosis factor?α gene polymorphism.methods:genomic dna from 41 healthy people was typed for tnf?α -308 polymorphism by allele?specific polymorphism chain reaction(as?pcr); the tnf?α concentration in the supernatant was measured by elisa.results:the tnf?α production of tnf?α -308 non?g/g genotype in lps?inhibited peripheral blood mononuclear cell(pbmc) culture was more than that of g/g genotype; compared with tnf?α -308 non?g/g genotype peripheral blood mononuclear cell(pbmc), triptolide can lower the production of tnf?α in g/g genotype peripheral blood mononuclear cell(pbmc).conclusion:tumour necrosis factor α(tnf?α) gene polymorphism might influence the tnf?α secretion of peripheral blood mononuclear cell(pbmc) in healthy humans. we speculate that it may be relative to the different curative effect of tripterygium wilfordii hook.f.(twhf) to ra patients.

［key words］ triptolide；tumor necrosis factor tnf?α；pbmc；gene polymorphism

类风湿关节炎（ra）是一种与多种遗传因素相关联的自身免疫性疾病，其发病过程涉及到多种炎性细胞因子。肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，tnf?α）是其中重要细胞因子之一，tnf?α是一种具有广泛生物活性的炎性细胞因子，在类风湿关节炎的发病过程中起到重要作用。tnf?α基因组中多个位点存在基因多态性，如-308、-238、+498等，其中以-308位点的基因多态性可能与类风湿关节炎的易感性、药物疗效和预后情况之间的关系较密切［1?5］。雷公藤甲素(triptolide，tp)，又称雷公藤内酯醇，是从雷公藤中分离得到的环氧二萜内酯化合物，是雷公藤主要活性成分之一，具有较强的抗炎和免疫抑制作用。本文欲研究tnf?α基因多态性及其对雷公藤甲素抑制外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, pbmc)分泌tnf?α的影响。

1 材料与方法

1.1 对象 从本院体检中心随机选取41名汉族健康成人，年龄21～50岁，平均33.10岁，男性24名，女性17名，均无自身免疫性疾病病史和相关疾病家族史。每名志愿者抽取肘静脉血8 ml，其中2 ml用来提取dna和进行基因亚型检测，6 ml用来进行细胞培养。

1.2 试剂 全血基因组dna提取试剂盒（gentra systems）；rpmi1640培养基（hyclone）；lps（sigma）；人tnf?α elisa试剂盒（pierce）；pcr引物由上海生物工程技术有限公司合成；雷公藤甲素由福建医学科学研究所提供，以二甲基亚砜（sigama）助溶，磷酸盐缓冲液（pbs）稀释，配制成240 ng/ml的贮存液。

1.3 主要仪器 uv1101核酸分析仪（德国，biometra）；pcr扩增仪（美国，mj research）；凝胶成像分析系统（英国，uvp公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；co2培养箱（美国，shel?lab）；全自动酶标测试仪（美国，bio?tek instruments）；倒置显微镜；高速离心机等。

1.4 基因多态性的检测

1.4.1 dna的抽提 抽取健康志愿者外周静脉血2 ml于edta抗凝的采血管中，用gentra公司dna标准抽提试剂盒抽提dna，并通过核酸分析仪分析，保证dna样品纯度在1.8～2.0之间。

1.4.2 tnf?α -308位点基因多态性检测 利用等位基因特异引物pcr(as?pcr)方法来检测tnf?α -308位点的基因多态性，参照warzocha等［6］和林经安等［7］报道的引物序列，委托上海生物工程技术服务公司合成，序列为f1：5′?tctcggtttcttctccatcg?3′，r1：5′?ataggttttgaggggcatgg?3′，r2：5′?ataggttttgaggggcatga?3′和r3：5′?gagtctccgggtcagaatga?3′， 其中r1和r2序列的差别仅在3′末端由g变为a，r3为内对照引物负链，f1和r1/r3组成检测tnf1内对照引物对，f1和r2/r3组成检测tnf2内对照引物对。

1.4.3 pcr反应体系及条件 pcr反应体系包括10×buffer缓冲液5 μl，25 mmol/l mgcl2溶液4 μl，10 mmol/l dntp 1 μl，taq聚合酶5 u，110 pmol/l引物f1、r1（r2）、r3分别为5、2.5和2.5 μl，dna模板5 μl，双蒸水20 μl，整个反应体系共50 μl。pcr反应条件为95℃预变性10分钟，95℃变性90秒，60℃退火150秒，72℃延伸60秒，共34个循环，72℃延伸7分钟。

1.4.4 电泳分析 取pcr产物6 μl，在2%琼脂糖凝胶电泳，每管样本pcr产物均出现531 bp的内参照条带，以出现184 bp条带的反应管来判断为tnf1或tnf2纯合基因型，或者是tnf1/2杂合型，见图1。

1.5 外周血单个核细胞的分离与培养 用ficoll淋巴细胞分离液无菌分离外周血单个核细胞，重悬于完全1640液（含10%小牛血清），制成细胞悬液，并调整细胞终浓度为1×106 ml-1，并加到96孔培养板中，每孔150 μl，置37℃、5%co2细胞培养箱预培养24小时后，进行加药干预培养，设置脂多糖对照组（lps）、雷公藤甲素加脂多糖实验组（tp+lps），使脂多糖的终浓度为1 μg/ml，雷公藤甲素浓度为4.5 ng/ml，置37℃、5%co2细胞培养箱继续培养48小时后结束，离心收集培养基上清液，保存于-70℃冰箱待检。

1.6 tnf?α的检测 利用elisa试剂盒来检测上清液中细胞因子tnf?α的含量，按照说明书操作，酶标测试仪450 nm处读数。

1.7 统计学处理 本文数据利用spss 11.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 tnf?α -308基因多态性检测结果 在41例健康志愿者中，tnf?α -308位点g/g、g/a、a/a三种基因型例数分别为34、6和1例。

2.2 tnf?α基因多态性的影响 已有研究证实g/a和a/a基因型均可使tnf?α基因表达增加,且a/a基因型在人群中出现的频率低，故将g/a基因型和a/a基因型合并分析。tnf?α -308a+（g/a,a/a）健康人pbmc经lps刺激后分泌tnf?α的量明显较tnf?α -308a-（g/g）高（p<0.05），加入雷公藤甲素联合刺激后，对于a-（g/g）健康人pbmc，lps+tp联合刺激组tnf?α分泌量明显低于lps单独刺激组（p<0.05），而对于a+（g/a,a/a）健康人pbmc，lps+tp联合刺激组tnf?α分泌量与lps单独刺激组无显著差异（p>0.05），见表1。

图1 正常人淋巴细胞tnf?α -308位点的不同基因型pcr检测产物的电泳图谱（略）

fig.1 electrophoretogram of different tnf?α -308 gene type in normal lymphocyte

note:m.puc mixdna marker;1,2.homogenic tnf1;3,4.homogenic tnf2;5,6.heterogenic tnf1/2.

表1 雷公藤甲素对pbmc分泌tnf?α 的影响 （略）

tab.1 effect of triptolide on tnf?α produced by pbmc

note:1) compared with 2),p<0.05；1) compared with 3),p<0.05；3) compared with 4),p>0.05.

3 讨论

类风湿关节炎（ra）是一种与多种遗传因素相关联的自身免疫性疾病，虽然hla?dr基因在ra的发生发展中起着重要的作用，但其并不能解释ra的整个遗传背景，越来越多的证据表明，细胞因子的基因多态性影响ra的病情［8］。ra发病过程涉及多种炎性细胞因子，肿瘤坏死因子α则是其中重要细胞因子之一。肿瘤坏死因子α主要由单核巨噬细胞、淋巴细胞分泌，具有广泛的诱导炎症和免疫调节功能。编码tnf?α位于染色体6p21.3，在mhc?ⅲ类基因区内，与mhc基因紧密连锁［1］。在肿瘤坏死因子α 5′端基因调节区多个位点存在基因多态性，而在这些位点中，以-308位点基因多态性与类风湿关节炎的发病，治疗及以后有较密切的关系［2?5］。

本实验利用等位基因特异引物pcr(as?pcr)方法来检测tnf?α -308位点的基因多态性，该方法主要用于检测已知的基因位点改变。在tnf?α -308位点的二种不同基因型的引物链序列3′末端分别采用g和a，使得tnf1中的g在tnf2正链序列的3′末端a不能退火，同样的tnf2中的a在tnf1正链序列的3′末端g不能退火，这种差别决定了不同基因型在扩增过程的特异性，当两种不同基因型引物pcr均阳性时，则判断为杂合型，无需pcr后的操作［7］。本文结果显示，等位基因特异引物pcr（as?pcr）方法能有效地检测tnf?α -308位点的基因多态性，内对照引物的同时扩增，确保了pcr反应的可靠性。

随着遗传药理学和药物基因组学的不断深入研究, 人们发现药物的疗效和不良反应存在个体差异的潜在原因, 除了与疾病的轻重，个体情况（年龄、营养、肝肾功能），伴发疾病等有关联外，更主要的原因可能是源于个体基因差异。这种基因上的多态性可能导致药物代谢酶，药物转运体对药物代谢产生差异，而药物受体或药物靶标也可能对药物敏感性产生差异，这些差异的存在可能是导致药物治疗中个体间存在疗效和不良反应差异的重要原因［9，10］。

tnf?α作为许多药物在体内的作用靶标, 其基因多态性很可能会影响到药物的临床功效。几组实验研究发现, tnf?α -308位点的基因多态性可以导致tnf?α转录水平的不同，从而导致体内tnf?α水平的不同, 而这种差异性的存在则可直接影响到药物的临床疗效［11，12］。balog等［3］给予类风湿关节炎病人和克罗恩病人(crohn’disease)抗?tnf抗体药物infliximab治疗，发现a+（g/a,a/a）的病人对infliximab疗效评价明显低于a-（g/g）病人，这表明a+(g/a,a/a)ra患者治疗难度可能较a-(g/g)ra患者高，同时提示我们tnf?α -308基因多态性不仅可以作为疾病易感性和预后性的筛选指标，也有助于我们个性化选择药物治疗。

雷公藤甲素是从雷公藤中分离得到的二萜内酯化合物, 具有较强的抗炎和免疫抑制作用, 其主要作用途径之一就是抑制pbmc的活化与增殖，并可诱导其凋亡［13，14］。研究表明雷公藤多苷可以降低人体血浆内tnf?α水平, 雷公藤单体t4还可以抑制经过lps刺激培养的pbmc在体外产生tnf?α［15，16］。雷公藤在临床用于治疗类风湿关节炎已经多年，其临床疗效在不同个体间存在一定的差异。肿瘤坏死因子α(tnf?α) 作为雷公藤在体内的药物作用靶标之一, 我们推测其基因多态性可能是导致雷公藤治疗类风湿关节炎疗效存在个体差异的重要原因之一。

通过本实验发现，在脂多糖（lps）的刺激下，a+（g/a,a/a）的健康人pbmc分泌tnf?α的量明显高于a-（g/g）健康人，这与louis等［17］的研究结果是一致的。在给予脂多糖（lps）和雷公藤甲素联合刺激后，发现a+（g/a,a/a） 细胞中tnf?α的量与脂多糖（lps）单独刺激后分泌的量并没有明显差异，相反的是，在a-（g/g）细胞中，lps+tp组较lps组分泌的量有明显的降低。这说明雷公藤甲素对携带tnf?α -308g/g基因型组pbmc有明显的抑制作用，而对tnf?α -308非g/g基因型组pbmc可能没有明显的抑制作用。因此我们推测雷公藤治疗类风湿关节炎个体疗效差异与tnf?α -308基因多态性之间存在关联。由于a+（g/a）在人群中分布频率较低，尤其是a+（a/a），这一结果有待于进一步在较大范围以及ra病人中进行研究确证。

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