人源TNF-α抗体基因的克隆与表达

[摘要] 目的:在原核系统中高效表达抗TNF-α单克隆抗体VH/K21,以便进一步研究其生物学功能,预测临床应用前景。方法:以已筛选获得的TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,产物与其表达质粒进行双酶切,连接后克隆进入PET22b(+)/BL21(DE3)感受态中并在该原核系统中实现可溶性表达;对表达产物进行Western blotting、ELISA鉴定。结果:成功克隆与表达出可溶性的高效表达的人源TNF-α单克隆抗体。序列分析表明该克隆具有全新的人源TNF-α抗体基因,它可以特异识别人TNF-α。结论:人源TNF-α单克隆抗体的获得为进一步研制应用于临床的TNF-α人源抗体奠定了基础,也将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础。

[关键词] 抗体;TNF-α;变应性鼻炎

[中图分类号] R765.21[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(c)-009-03

Cloning and expression of human TNF-α antibody gene

TIAN Lufang1, ZHAO Xiaoling2, ZHANG Kejun1, YANG Zhihua2

(1.Department of Otolaryngology, the First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China; 2.Department of Stress Medicine, Research Institute of Hygiene and Environmental Medicine, the Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

[Abstract] Objective: To express the TNF-α monoclonal antibody VH/K21 in the prokaryotic expression system, in order to further explore its biological functions and predict its clinical application prospect. Methods: The screened TNF-α antibody VH/K21 gene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET-22b(+)/BL21(DE3), and achieved soluble expression. The products were identified by Western blotting and ELISA. Results: The soluble and high expressed human TNF-α monoclonal antibody was successfully cloned and expressed. Sequence analysis suggested that this clone had fully new human TNF-α antibody gene, and it could specifically recognize human TNF-α. Conclusion: The obtain of human TNF-α monoclonal antibody lays a foundation for its clinical application, and would provide a theoretical and technical basis for the preparation of other human antibodies.

[Key words] Antibody; TNF-α; Allergic rhinitis

变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是由变应原激发的、由IgE介导的鼻部炎性疾病,是耳鼻喉科最常见的一种疾病,也是全球最常见的慢性疾病之一。随着人类现代生活方式和生态环境的急剧变化,AR的发病率在全球呈增长趋势[1-2],且城市的发病率远高于农村[3],已逐渐成为全球性的健康问题,虽非重大疾病,但对人们的工作、学习和生活产生了严重的影响。AR治疗原则主要为避免接触变应原、药物控制和免疫调节。目前AR的治疗还没有特效的治疗措施,常规的治疗只是缓解症状,减轻炎症,提高患者的健康度和生活质量。所以,找到一种治疗AR的最佳方法已经成为耳鼻喉科医师的研究热点。

研究发现,TNF-α在AR的发生、发展过程中起着至关重要的作用,用TNF-α的拮抗剂治疗AR成为一个新的研究热点。

本研究将已筛选得到的TNF-α抗体基因VH/K21进行克隆与表达,得到了TNF-α的人源抗体。此研究为进一步研制应用于临床的TNF-α人源抗体奠定了基础,也将为其他人源抗体的制备提供理论依据和技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

抗人IgG κ链抗体、HRP标记的抗人IgG κ链抗体及抗鼠IgG抗体购自美国eBioscience公司。PCR试剂盒、内切酶、T4连接试剂盒购自TaKaRa公司。琼脂糖凝胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒、PET22b(+)/BL21(DE3)感受态购自天根生物公司。

1.2 方法

1.2.1 VH/K21基因的PCR扩增以本室已筛选得到的人TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,94℃ 60 s,50℃ 80 s,72℃ 90 s,扩增30个循环后,琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2 VH/K21基因的克隆将VH/K21基因的PCR扩增产物及质粒PET22b(+)用限制性内切酶Not1和Nco1进行双酶切,双酶切的产物用PCR回收试剂盒进行回收,然后用T4连接酶连接,构建成VH/K21-PET22b(+)表达质粒,将该表达质粒转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,接种若干单菌落于5 ml含50 mg/L Amp的LB培养基中,37℃振荡培养过夜。产物用PCR试剂盒进行鉴定。

1.2.3 DNA序列分析将PCR鉴定阳性的克隆进行DNA序列分析,与已知的TNF-α抗体基因序列进行对比,看是否一致。

1.2.4 VH/K21基因的表达将DNA序列分析正确的克隆复苏后接种于新鲜的含50 mg/L Amp的LB培养基中,37℃培养至A600=0.6～1.0(0.1梯度),加IPTG诱导(终浓度为0.8～1.0 mmol/L),29℃振荡培养6～10 h,12 000 r/min离心5 min收集菌体。悬于裂解缓冲液中,超声破碎,离心收集上清和沉淀,产物待用于聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blotting检测。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测将离心得到的上清和沉淀进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,先80 V、10 min,再180 V、40 min。用考马斯亮蓝染液染色2 h,再用脱色液脱色。

1.2.6 Western blotting检测将发现可溶性蛋白的上清按一定浓度梯度进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,先80 V、10 min,再180 V、40 min。用转模仪转模后,将硝酸纤维素模用含有1∶1 200抗人IgG κ链的5%牛奶4℃孵育过夜。将膜用PBST缓冲液洗3次,每次10 min;然后用含1∶1 200二抗的5%牛奶室温孵育1 h,再用PBST缓冲液洗3次,每次10 min,然后用显影液显影。用未克隆入任何基因的空质粒PET22b(+)作阴性对照。

1.2.7人源抗体的抗原特异性结合活性检测将人TNF-α重组蛋白用包被液稀释成不同浓度,96孔板上每孔加60 μl,重复3个孔,用狂犬病毒糖蛋白(Gp)作阴性对照,PBS作空白对照,置湿盒中4℃过夜。加入用PBS稀释的纯化抗体,每孔70 μl,37℃ 1 h。加入HRP标记的抗人IgG κ链二抗,每孔50 μl,37℃ 1 h。A、B液显色,用H2SO4终止反应后,在450 nm波长下测定A值。

2 结果

2.1 VH/K21基因的PCR扩增

以本室已筛选得到的人TNF-α抗体基因VH/K21为模板进行PCR扩增,得到与已知TNF-α抗体基因序列大小一致的基因。见图1。

图1VH/K21的PCR扩增产物(箭头示)

(M:markerⅢ;1～4:VH/K21基因)

Fig. 1PCR products of VH/K21 gene (arrow shown)

(M: markerⅢ;1-4:VH/K21 gene)

2.2 VH/K21基因的克隆与PCR鉴定

将VH/K21的PCR产物与PET22b(+)质粒进行双酶切,连接后转化入E.coli BL21(DE3),挑取单克隆摇菌后进行PCR鉴定,其产物与已知基因序列大小一致。见图2。

图2VH/K21基因克隆与转化后的PCR鉴定结果(箭头示)

(M:markerⅢ;1:阴性结果;2～4:阳性结果)

Fig. 2PCR products of cloning and transformation

of VH/K21 genes (arrow shown)

(M: markerⅢ; 1: negative product; 2-4: positive products)

2.3 VH/K21基因的表达

将PCR鉴定阳性且测序正确的克隆诱导表达后,离心分为上清和沉淀,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,发现大量的可溶性表达蛋白。见图3。

图3 VH/K21基因表达产物电泳图

[M:marker;1:质粒PET22b(+);2:上清;3:沉淀;:表达蛋白]

Fig. 3Electrophoretogram of expression of VH/K gene

[M: marker; 1: plasmid PET22b(+); 2: supernatant; 3:precipitation;

:expressed protein]

2.4 Western blotting鉴定

将发现可溶性蛋白的阳性克隆的表达产物,超声离心后取上清按不同浓度梯度进行Western blotting鉴定,用空质粒PET22b(+)作阴性对照。结果显示,该可溶性蛋白可以特异性结合人IgG κ链,表明它是特异针对人的抗体。见图4。

图4含有可溶性蛋白的上清的Western blotting鉴定

[0:质粒PET22b(+);1～4:含不同浓度可溶性蛋白的上清]

Fig. 4Western blotting of supernatant containing soluble protein

[0: plasmid PET22b(+); 1-4: supernatant containing different

concentrations of soluble protein]

2.5 人源抗TNF-α抗体的特异性抗原结合活性检测

将人TNF-α重组蛋白用包被液稀释成不同浓度,包被96孔板,用Gp作阴性对照,PBS作空白对照,ELISA法检测该抗体的特异性抗原结合活性。结果显示,该人源抗体可以特异性地识别人TNF-α,而不能与Gp和BSA结合,表明它是特异针对TNF-α的人源基因工程抗体。见图5。

图5TNF-α抗体的特异性抗原结合活性

Fig. 5Specific binding of anti-TNF-α to antigen

3 讨论

TNF-α是一种促炎症反应细胞因子,在炎症反应和免疫反应的发生和发展中起着关键的作用。研究表明,过敏性鼻炎患者血清中TNF-α水平明显升高[4-5]。而TNF-α基因缺陷[TNF-α(-/-)]的小鼠致敏后其鼻黏膜中嗜酸粒细胞的数量及嗜酸粒细胞活化趋化因子的mRNA表达均较含有TNF-α基因的小鼠[TNF-α+/+(OVA)]明显减少。在TNF-α+/+(OVA)小鼠中存在的卵清蛋白特异性IgE的应答和IL-10 mRNA的表达在TNF-α-/-(OVA)小鼠中完全被消除,而且TNF-α-/-(OVA)小鼠打喷嚏、鼻痒等鼻部症状也明显改善[6],说明TNF-α可能是AR的很好的治疗靶标。2006年我国疾控中心的何杰等将含有可溶性的TNF-α受体和IgG Fc片段(sTNF-α-IgG Fc)的嵌合基因的质粒转移进入上皮细胞中后发现有大量的sTNF-α-IgG Fc融合蛋白表达,该蛋白可以在L929细胞上对抗TNF-α的溶细胞作用。将含质粒pGEG.sTNF-α-IgG Fc的溶液滴入AR小鼠的鼻黏膜中后发现其鼻部的症状明显改善,嗜酸粒细胞、肥大细胞、IL-5(+)细胞的数量也较对照组明显减少[7],表明TNF-α的拮抗剂对于AR的治疗可能是一种新的方法。如今,TNF-α抗体已经被应用于临床治疗类风湿性关节炎、克罗恩病等,且取得了良好的疗效[8-10]。Adalimumab是第1个用于AR治疗的人源抗TNF-α抗体,其临床效果已得到证实,但国内尚未有类似的产品报道[11-12]。

由于TNF-α在临床上的重要性日益突出,制备一种能应用于临床诊断和治疗、且较为经济的TNF-α抗体的要求也越来越迫切。现在临床上应用的TNF-α抗体主要有3种,分别是鼠源性TNF-α抗体、人鼠嵌合型TNF-α抗体和人源性TNF-α抗体。前2种由于其免疫原性过高而存在较明显的副作用。Abbott公司应用噬菌体展示技术开发的一种人源性的TNF-α抗体,现称为Adalimumab,虽其临床效果已得到广泛的认可,且毒副作用较少,免疫原性较低,但其昂贵的治疗费用给大多数患者带来了沉重的经济负担。本文中人源TNF-α抗体的成功制备为进一步研究应用于临床的高特异性、高亲和力的TNF-α抗体奠定了基础,为AR的治疗提供了新思路和新方法。

[参考文献]

[1]张罗,周兵,韩德民,等.变应性鼻炎研究进展[J].耳鼻咽喉-头颈外科,2003,10(5):316-320.

[2]Ghouri N, Hippisley-Cox J, Newton J, et al. Trends in the epidemiology and prescribing of medication for allergic rhinitis in England [J]. J R Soc Med,2008,101(9):466-472.

[3]Tang S, Kang H, Zhu L, et al. Epidemiology investigation of allergic rhinitis in urban and rural areas of Ningbo and Yongzhou [J]. Lin Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi,2008,22(14):642-644.

[4]Wang Z. The effect of TNF-alpha & IL-8 in the pathogenesis of allergic rhinitis [J]. Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi,2006,20(23):1060-1061.

[5]Gorska-Ciebiada M, Ciebiada M, Gorska MM, et al. Intercellular adhesion molecule 1 and tumor necrosis factor alpha in asthma and persistent allergic rhinitis: relationship with disease severity [J]. Ann Allergy Asthma Immunol,2006,97(1):66-72.

[6]Masao L, Kuniaki S, Masao T, et al. TNF-α contributes to the development of allergic rhinitis in mice [J]. J Allergy Clin Immunol,2003,112(1):135-140.

[7]He J, Wang T, Yao LH, et al. Construction and delivery of gene therapy vector containing soluble TNF alpha receptor-IgG Fc fusion gene for the treatment of allergic rhinitis [J]. Cytokine,2006,36(5-6):296-304.

[8]González-Lama Y, López-San Román A, Marín-Jiménez I, et al. Open-label infliximab therapy in Crohn's disease: a long-term multicenter study of efficacy, safety and predictors of response [J]. Gastroenterol Hepatol,2008,31(7):421-426.

[9]Carbonell J, Badia X, grupo EXPRESAR. Expectations, preferences and satisfaction of patients with rheumatoid arthritis receiving infliximab treatment [J]. Med Clin (Barc),2008,131(13):493-499.

[10]Feldmann M, Maini RN. Anti-TNF alpha therapy of rheumatoid arthritis: what have we learned? [J]. Annu Rev Immunol,2001,19:163-196.

[11]Mease P. Infliximab (Remicade) in the treatment of psoriatic arthritis [J]. Ther Clin Risk Manag,2006,2(4):389-400.

[12]Bombardieri S, Ruiz AA, Fardellone P, et al. Effectiveness of adalimumab for rheumatoid arthritis in patients with a history of TNF-antagonist therapy in clinical practice [J]. Rheumatology (Oxford),2007,46(7):1191-1199.

(收稿日期:2009-03-03)