索拉菲尼对不同人肝癌细胞株抑制增殖及促凋亡作用的研究

摘要：目的 探讨索拉菲尼对不同人肝癌细胞株抑制增殖、促进凋亡作用及敏感性。方法 体外培养肝癌细胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC，各细胞株分为实验组及对照组，以不同浓度索拉菲尼对实验组进行干预，通过CCK8法检测出不同细胞株细胞凋亡的IC50值，实验组与对照组再进行流式细胞学对比检测分析，进而得出对索拉菲尼相对敏感及不敏感肝癌细胞株。结果 索拉菲尼对六种人肝癌细胞株PLC、HepG2.2.15、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMCC7721均有明显的促凋亡作用，对它们作用的IC50值分别为5.3umol/L、5.3umol/L、6.8umol/L、7.0umol/L、11. 7umol/L、15.0umol/L。结论 索拉菲尼对人肝癌细胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC均有明显的抑制增殖和促凋亡作用，其作用相对敏感细胞株和不敏感细胞株分别为PLC和SMCC7721。

关键词：索拉菲尼；肝癌；细胞株；凋亡

索拉菲尼（Sorafenib，商品名：多吉美）是一个多靶点的分子靶向药物，对Raf-1激酶，VEGFR2、3，FLT3，Ret、C-kit，PDGFR等靶点有抑制作用[1～3]。 目前已有多项研究证明索拉菲尼对晚期原发性肝细胞癌（HCC）有明显、确切的疗效，能明显延长晚期肝癌的生存时间[4～6]。但在针对索拉菲尼对不同人肝癌细胞株的各项实验研究结果中，其对不同细胞株的作用效果存在差异[4，7]。本研究以肝癌细胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC为研究对象，通过实验得出它们不同的IC50值，并且选出对索拉菲尼相对敏感及不敏感细胞株，为将来相关实验研究的细胞株选择提供参考。

1资料与方法

1.1一般资料 人肝癌细胞株Huh7、HepG2 、SMCC7721、 PLC（中国科学院上海细胞库），HepG2.2.15购自上海复祥生物科技有限公司，MHCC-97H（上海中山医院肝癌研究所），CCK8试剂盒（美国Sigma公司），Annexin-PE/7-A凋亡检测试剂盒（美国Becton&Dickinson公司）， 索拉菲尼（德国拜耳免费提供）。

1.2方法

1.2.1细胞准备 将各HCC细胞株接种在含10%小牛血清，1%青霉素、链霉素的DMEM培养基中，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞生长良好呈单层贴壁生长，将于对数生长期的各株细胞计数并制成细胞悬液，，低倍显微镜下逐一计数4大格的细胞数。计数板上每大格含16小格，计数时每小格在上、左的压线细胞计入，而压线于下、右的细胞排除不计。计数完成后按细胞密度公式计算：细胞悬液的细胞数/ml=（四个大格子细胞数/4）×104 。反复操作细胞计数3次取平均值以确保结果准确。每种细胞株设对照组（细胞悬液+DMSO）、实验组（细胞悬液+索拉菲尼）。

1.2.2流式细胞学检测 将浓度为2×105/ml呈指数生长的细胞悬液接种于6孔板，每孔2.5ml（即5×105/孔），细胞培养箱内孵育1d，对照组每孔加入0.5mlDMSO，实验组每孔加入索拉菲尼0.5ml溶液（终浓度为4uM），每组设三个复孔，然后置培养箱内孵育3d，不含EDTA的胰酶消化收集、离心细胞，PBS液洗涤2次（每次均以2000rpm离心5min），以500ul的Binding Buffer重悬细胞，先后加入5ul Annexin V-FITC和5ul Propidium Iodide，混匀，室温避光反应10min，在1h内上流式细胞仪检测记录结果。流式细胞仪参数设定：激发波长Ex=488nm，发射波长Em=530nm；Annexin V-FITC的绿色荧光和PI红色荧光分别通过FL1和FL3通道检测。

1.2.3CCK8法检测 每种细胞设空白组（培养液+CCK-8）、对照组（细胞+培养液+CCK-8）、实验组（细胞+培养液+索拉菲尼+CCK-8）。调整细胞悬液浓度为5x107/L，96孔板中每种细胞各组设4个不同索拉菲尼作用浓度，每个浓度设3个复孔，对照组内加入培养液200ul，实验组内加入不同量的索拉菲尼溶液，余量液体用培养液补足，使每孔液体量为200ul，在细胞培养箱内孵育24h；各组每孔加入10ul CCK-8溶液，放入细胞培养箱内孵育2h。酶标仪在450nm波长比色测定每孔吸光度（A）值，记录结果。细胞存活率（%）= [（Aa-Ab）/（Ac-Ab）]×100%，Aa：实验孔，Ab：空白孔，Ac：对照孔。IC50值为细胞存活率为50%时的索拉菲尼浓度。

1.3统计学处理 所有数据采用SPSS 13.0软件分析。流式细胞、CCK-8复孔结果都以（x±s）表示，不同实验方法各组细胞株的实验组与对照组比较用t检验，P

2结果

流式细胞检测 每株细胞流式细胞仪检测取"十字门"的右上象限（UR）的读数结果，Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC实验组肝癌细胞株经索拉菲尼作用后凋亡均较对照组明显增加（P

CCK8测索拉菲尼对各肝癌细胞株存活率的结果 索拉菲尼对六种人肝癌细胞株PLC、HepG2.2.15、Huh7、HepG2、MHCC97H、SMCC7721均有明显的促凋亡作用，其IC50值分别为5.3umol/L、5.3umol/L、6.8umol/L、7.0umol/L、11. 7umol/L、15.0umol/L。对索拉菲尼相对敏感细胞株和不敏感细胞株分别为PLC和SMCC7721（见图3）。

3讨论

近几年来出现的新型口服的分子靶向抑制药物索拉菲尼，经过三期临床实验证实疗效后已应用于治疗晚期HCC患者， 多项研究证明索拉菲尼对晚期HCC有明显确切的疗效[4～6]，索拉菲尼已被确立成为晚期HCC的一线标准治疗[8]。

以往研究表明，索拉菲尼抗肿瘤机制主要是抑制Raf，下调pMEK、pERK表达抑制HCC细胞系的增殖，诱导HCC细胞凋亡，靶向抑制VEGFR和PDGFR抗肿瘤血管生成[3]，与血管形成有关因子如VEGF、PDGF 等在肿瘤细胞及其周围环境均异常高表达，这与HCC的发生、发展密切相关，也与新生肿瘤血管的形成、门静脉癌栓和周围侵犯有联系[9]。PI3K/Akt/mTOR信号转导通路在肿瘤细胞增生、分化、生长、代谢、转移的过程中起重要作用[10]。以上检测索拉菲尼作用的实验研究中，常用的细胞株有Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC，但索拉菲尼干预在各实验研究的结果有不同之处[3，4]，如索拉菲尼作用HepG2细胞株后的IC50就有（4.5±1.6）umol/L、（7.3±1.3）umol/L等不同数值[3，9]，其原因可能是由于实验误差、细胞株传代差别、索拉菲尼药品制备过程的不同造成，目前尚无实验将以上各细胞株纳入统一研究，这样就给后来的研究者在阅读文献时带来困惑，亦对预选进行实验的细胞株带来困难。

本实验以索拉菲尼干预不同肝癌细胞株为研究对象，通过流式细胞检测发现，索拉菲尼对实验组肝癌细胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15、PLC抑制生长和促凋亡作用均明显强于对照组（P

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