基于荧光测序分型技术的六味地黄丸原料分子鉴别研究

[摘要] 该文选择成药六味地黄丸为研究对象，建立了一种用于中成药原料药材基原鉴定的荧光测序分型技术。首先以原料药材丹皮DNA为模板，筛选最适荧光标记鉴别引物，即通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction， PCR）分别对5个FAM荧光标记引物psbA-trnH，ITS，trnL-trnF，matK，rbcL序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，所得测序结果使用GeneMarker V1.80进行分析。根据分析结果最终选择psbA-trnH荧光标记引物来鉴别六味地黄丸及其原料药材。结果表明，通过psbA-trnH荧光标记引物扩增分析，可以准确鉴定出六味地黄丸中的丹皮，山药，泽泻3种原料药材。研究结果说明，采用分子荧光测序分型技术鉴定中成药原料具有一定的可行性。

[关键词] 中成药； 分子鉴别； FAM荧光标记； psbA-trnH

六味地黄丸最早记载于宋代钱乙《小儿药证直诀・卷下诸方》，由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、丹皮、茯苓组成，是中医滋补肾阴的代表方剂，在中成药中具有极其重要的地位。现代药理研究表明，六味地黄丸有增强免疫、抗肿瘤[1]、抗衰老[2]、降血糖、降血脂，降血压、防癌抗癌对泌尿生殖系统。内分泌系统和心血管系统有明显的影响[3-4]。临床主要用于治疗糖尿病肝肾阴虚[5]、高血压[6]、肾炎[7]等疾病。在2010年版药典中，规定以检测牡丹皮中的丹皮酚和酒萸肉中的马钱苷的含量作为六味地黄丸质量控制的指标[8]。但这2种成分在其他药材中也存在，且六味地黄丸的成分十分复杂，仅测定其中的2种成分很难真实客观地反映其原料药材的真伪，因此需要寻找更好的质量控制方法。

利用分子生物学技术依据遗传物质DNA在不同生物个体的差异鉴别生物物种，具有快速、微量样本、不受外界环境条件的影响、鉴别特异性强等特点，在中药材品种鉴别领域显示出极强的优势。但目前该技术在中成药中原料药材鉴别应用报道较少，Megan等采用高通量测序技术对牙痛一粒丸等15种中成药中的原料药材进行了分子鉴定[9]；崔占虎等[10]基于序列分析方法，利用选择叶绿体基因片段psbA-trnH和rbcL对连翘败毒丸中的19种原料药进行分子鉴定，结果表明大黄、苦地丁、金银花、苦参、麻黄、荆芥等10种原料药材的物种基原可以鉴定出来，但以上2种方法测定时间较长，且数据处理复杂。

荧光测序分析技术是通过对荧光标记的DN段进行检测，结合相对分子质量内标对样品DN段长度进行计算，并根据DN段长度差异进行物种鉴别。本文拟利用该技术建立六味地黄丸中的丹皮等原料药材基原真伪鉴别方法，为六味地黄丸的质量检控提供了新的技术手段，也为中成药质量控制及人们用药安全提供支撑。

1 材料与方法

1.1 样品

丹皮基原植物9株、地黄基原植物3株，分别采自安徽、山东、北京、河南等地；丹皮药材6批，山茱萸药材2批、山药药材3批、地黄药材3批和泽泻药材2批以及成药六味地黄丸均购自市场。凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心和安徽中医学院，实验材料采集及鉴定信息见表1。

1.2 试剂

2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），DNA Taq聚合酶（Takara公司），2 000 bp DNA Marker（Takara公司），GENESCAN 500LIZ内标（ABI公司，货号4322682），GENESCAN 1200LIZ内标（ABI公司，货号4397728），DNA纯化试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），牛血清白蛋白BSA S100（江晨生物），聚乙烯吡咯烷酮 PVP40（江晨生物），三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。

1.3 仪器

PCR仪（ABI公司，型号 9700），电泳系统（北京市六一仪器厂，型号 DYY-12），低温冷冻离心机（德国Eppendorf， 型号 5810R），紫外凝胶成像分析仪（英国Syngene， 型号 GBOXHR），混合型球磨仪（德国Retsch，型号 MM400），微量移液器（德国Eppendorf）。

1.4 荧光标记引物的选择及修饰

本实验选择5对通用引物，包括核内转录间隔区序列（ITS），叶绿体基因间隔区 （psbA-trnH和trnL-trnF）和叶绿体编码区（matK和rbcL）[11-13]。分别在每对引物的正向引物的5′端进行FAM荧光标记修饰。引物序列及反应条件见表2。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 总DNA提取及PCR扩增

1.5.1 DNA提取 六味地黄丸取适量样品，研磨破碎装入50 mL 离心管中，采用改良CTAB法提取总DNA。原料药材或基原植物取适量的样品，研磨破碎装入2.0 mL微量离心管中，采用改良CTAB法提取原料药材的总DNA。

1.5.2 DNA纯化 分别将提取后的六味地黄丸、原料药材熟地黄总DNA使用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后的DNA置于-20 ℃备用。

1.5.3 PCR扩增 反应体系总体积为20 μL，包括10×buffer缓冲液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL，Ex Taq 0.2 μL，DNA 0.5 μL，灭菌蒸馏水14.7 μL。六味地黄丸扩增体系总体积仍为20 μL，其中减少灭菌蒸馏水的体积，加入BSA 0.5 μL，PVP 1 μL。各对引物PCR反应条件见表2。反应结束后在PCR体系中加入5 μL 6×loading buffer，混匀后于EB染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，SYNGENE凝胶成像系统观察、成像。

1.6 测序分析

PCR产物由北京睿博兴科生物技术有限公司测序部测序。使用psbA-trnH引物扩增的所用样品目的片段小于500 bp，选择GENESCAN 500LIZ内标进行测序，使用ITS，matK，trnL-trnF和rbcL 4对引物扩增的所有样品目的片段接近或大于500 bp，选择GENESCAN 1200LIZ内标进行测序。将所有测序所得结果使用GeneMarker V1.80软件进行分析。

2 结果

2.1 荧光标记引物的筛选

选择15个丹皮样品DNA作为模板，使用表2中反应条件分别对5对荧光标记引物ITS，psbA-trnH，matK，trnL-trnF，rbcL进行PCR扩增。结果表明5种引物的PCR成功率差异较大，其中psbA-trnH的PCR成功率为100%，而rbcL仅为13.3%。从扩增产物的类型上看，matK和trnL-trnF均为单峰类型，rbcL为双峰类型，psbA-trnH为五峰类型，ITS引物的峰型表现为双峰未完全分开或单峰脱尾，具体分析见表3。根据扩增效率以及扩增结果的多态性综合分析，本文选择psbA-trnH荧光标记引物用来鉴别六味地黄丸中的原料药材基原。

2.2 荧光测序分型方法重复性及稳定性考察

取3份来自北京的丹皮基原植物样品适量，分别提取总DNA，使用psbA-trnH荧光标记引物进行PCR扩增，扩增后产物选择GENESCAN 500LIZ内标进行测序。将测序结果进行分析，发现同一批的3份样品测序结果完全一致，即3份样品扩增后均出现5个峰，峰值依次为449，450，450.9，452，453，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

2.3 丹皮基原植物及药材荧光测序分析

通过上述引物筛选，选择psbA-trnH荧光标记引物来扩增9份丹皮药材基原植物，测序分析结果表明，所测的9份样品共出现3种不同类型特征峰，每种类型都有5个峰，第1种类型（5份）的峰值分别为449，450，450.9，452，453；第2种类型（3份）的峰值分别为451，452，452.7，454，455；第3种类型（1份）的峰值分别为453，454，454.7，456，457。上述每种类型不同样品间第3个峰值相差最大为±0.2。

随机购买丹皮药材6批，利用psbA-trnH荧光标记引物进行PCR扩增及测序，分析结果表明6批药材中存在2种类型特征峰（类型1、类型3），且与丹皮基原植物的峰值相比差值小于0.3。

2.4 其他原料药材及基原植物荧光测序分析

由于茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （Schw.） Wolf 的干燥菌核，因此无法使用叶绿体基因进行真伪鉴别。除茯苓和丹皮外，利用psbA-trnH荧光标记引物对六味地黄丸中其他4种药材进行了PCR扩增和测序分析。

地黄：3份地黄基原植物均扩增出PCR产物，且测序结果表明地黄样品存在2个特征峰，峰值分别为526，527；但3份经过炮制后的熟地黄样品未获得扩增产物。

酒萸肉：2份酒萸肉药材均在413处出现1个特征峰，但峰高度小于100。这可能与该药材经过酒制，DNA提取效率低，影响PCR扩增，扩增效率极低。

泽泻：4份泽泻药材均存在5个特征峰，峰值分别为442，443，444.1，445，446，且不同样品间峰值差值均小于0.2。

山药：原料药材山药存在2个特征峰，峰值分别为398，398.8。

2.5 六味地黄丸中原料药材荧光测序分析

选择纯化后的六味地黄丸总DNA为模板，使用psbA-trnH荧光标记引物进行梯度PCR扩增，退火温度分别为52，54，56，58 ℃。不同原料药材适宜的退火温度存在差异，其中丹皮药材在56 ℃条件下扩增效率最高，峰值高度可达到5 000左右；泽泻在58 ℃退火温度条件下，扩增效率最高；山药在56 ℃退火温度条件下扩增效率最高。与药材对照相比，六味地黄丸中可检测出丹皮、泽泻、山药原料药材的特征峰，没有检测到地黄和酒萸肉的特征峰，这可能与炮制药材DNA在成药DNA中的浓度极低有关（图1）。

3 讨论

中成药原料药材的基原鉴别是中药鉴定领域中的难点和热点问题，传统的化学鉴别技术已经不能满足目前对成药安全性、有效性鉴别的需要。对于成药中原料药材的真伪鉴别、多来源鉴别、产地鉴别、年限鉴别等，如何选择准确、高效的鉴别技术，建立适合中成药的鉴别体系已成为目前亟待解决的问题。利用分子生物技术有望在成药原料药材基原鉴别中实现突破，这主要取决于以下几个方面。

3.1 成药DNA的提取

对于中成药来说，与药材不同，中成药DNA提取具有一定的难度，主要表现在以下几个方面：①由于部分中成药炮制过程中会添加一些辅料，液体辅料如酒，米醋，蜂蜜，食盐水，生姜汁，甘草汁，黑豆汁，麻油等，固体辅料如稻米，麦皮，白矾，灶心土，蛤粉，滑石粉，河砂，朱砂等，这些辅料对主药可起协调作用，或增强疗效，或降低毒性，或减轻副作用，但是这些辅料的添加也同时对DNA提取以及PCR扩增起到阻碍作用；②中成药所用原料药材比较多，而原料药材有的是经过不同炮制方法之后而入药，使得DNA提取十分困难，也为成药原料分子鉴别带来了不可避免的麻烦。同时由于成药原料药材比较多，且来源复杂，植物药中常含有植物多糖[14]、植物多酚[15]、木聚糖、果胶等，而动物药中常含有胆酸、胆红素、胶原质[16]等。这些物质作为PCR抑制物，可以显著抑制PCR扩增效率，从而影响PCR扩增结果[17]；③中成药剂型种类繁多，工艺差异大，不同剂型的制备工艺也相差甚远，因此不同剂型的DNA提取方法也是有差异的，要根据不同剂型选择最适宜的提取方法。

在本实验中，中成药在纯化之前都未能扩增出条带，而使用DNA试剂盒进行纯化后，将里面含有的杂质去除掉，降低其对PCR的抑制作用，可以扩增出条带，为后面的鉴别工作奠定了良好的基础。但对药材中炮制原料DNA提取仍存在一定的问题，限制了中成药分子鉴别的适用范围。

3.2 鉴别引物的筛选

筛选扩增效率高、多态性高的引物作为荧光标记引物是中成药原料药材基原鉴别成功的关键。目前一些基因片段被应用于植物物种鉴别，其中包括核内部转录间隔区（ITS）， 叶绿体基因间隔区（如psbA-trnH， atpF-atpH， psbK-psbI） 还有叶绿体编码区（如matK， rbcL， rpoB， rpoC1） 等[11-13，18-20]。经过对这些候选序列进行综合评定后发现，rbcL，matK，ITS 和psbA-trnH 序列较易扩增 [11，21-22]，且由于ITS 和psbA-trnH 2个序列保守性和多态性兼备等特点被更广泛的应用于药用植物鉴定中。本实验中仅psbA-trnH引物可以在单一退火温度下，即一次PCR反应条件下，将丹皮药材的所有样品全部扩增出，这为鉴别工作节省了时间。且与其他引物相比，本实验使用psbA-trnH引物可获得多种变异类型，有利于实现丹皮种质的正确鉴别。

3.3 检测技术的灵敏性

荧光标记技术具有高灵敏度、高稳定性，且应用范围较为广泛等特点。截至目前，荧光标记技术已广泛应用于蛋白质和核酸分析研究，如荧光标记蛋白[23]、荧光标记药物[24]、荧光标记核酸和多肽[25]等。而与其他分子标记相比，荧光标记方法体现出操作简单、易于检测和重复性好的优势，且数据处理简单，可一次性检测多种药材原料，有望成为中成药原料药材鉴定分析的有效手段。

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Study on fluorescence sequencing typing technology identification of

raw materials in Liuwei Dihuang pill

CUI Zhan-hu1，2， HUANG Lu-qi1， YUAN Yuan1*， LI Min-hui1，2， JIANG Chao1， ZHOU Li-she2

（1.State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center for Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medicinal Sciences， Beijing 100700， China；

2. Baotou Medical College， Baotou 014060， China）

[Abstract] In this paper， Liuwei Dihuang pill was used to study the identification of Chinese patent medicine by fluorescence sequencing typing technology. The DNA of Paeonia suffruticosa was used as template to amplify by five pair of FAM fluorescence labeling primers. Then， the amplified products were sequenced. The sequencing results were analyzed by GeneMarker V1.80 to screen the best fluorescence labeling primers. As a result， psbA-trnH fluorescence labeling primer was used to identify the raw materials of Liuwei Dihuang pill. The results showed that three kinds of raw plant medicinal materials in Liuwei Dihuang pill were able to be correctly identified by psbA-trnH fluorescence labeling primer. The fluorescence sequencing typing technology can stably and accurately distinguish raw medicinal materials in Chinese patent medicine.

[Key words] Chinese patent medicine； molecular identification； FAM fluorescence labeling； psbA-trnH

doi：10.4268/cjcmm20141907