10种中药对产ESBLs大肠埃希菌的体外抑菌活性

[摘要] 目的 测定乌梅等10味中药对产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌的体外抑菌活性，明确其最低抑菌浓度（MIC），为临床应用中药治疗产ESBLs大肠埃希菌感染提供参考依据。 方法 各收集10株产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌，制备适当浓度的各种中药煎液备用。采用琼脂稀释法进行定量抑菌试验，分别测定和比较各种中药的MIC值。对抑菌作用明显的中药进行产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌MIC比较。 结果 中药乌梅、五倍子、黄连、黄芩、黄柏、穿心莲、鱼腥草、重楼、金银花、连翘对产ESBLs大肠埃希菌的MIC值分别为（17.19±4.94）mg/mL、（18.75±6.59）mg/mL、（37.50±10.21）mg/mL、（46.20±15.10）mg/mL、（450±105.41）mg/mL、（475±79.06）mg/mL、（237.50±39.53）mg/mL、（118.75±59.29）mg/mL、（425±88.19）mg/mL、（225±52.70）mg/mL，其中乌梅、五倍子、黄连、黄芩的MIC均值分别为17.19 mg/mL、18.75 mg/mL、37.50 mg/mL、46.20 mg/mL，有较好的抑菌效果。乌梅、五倍子、黄连、黄芩对产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌MIC值经统计学处理，P > 0.05。 结论 10味中药对产ESBLs大肠埃希菌株均有不同程度的体外抑菌活性。其中乌梅和五倍子效果最强，其次是黄连、黄芩，其余的中药抑菌活性较弱。

[关键词] 中药；大肠埃希菌；超广谱β-内酰胺酶；药物敏感试验

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）31-0065-03

众所周知，大肠埃希菌是医院内感染常见的病原菌，随着抗生素的广泛使用，细菌的耐药性问题也趋于严重[1]。有报道称产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌已占临床分离到的大肠埃希菌60.1%[2]。因此，探寻新的不同于抗生素的抗菌药物对于改善产ESBLs大肠埃希菌感染性疾病的治疗现状具有重要意义。近年来许多研究表明中药具有抑菌的生物活性[3-6]。本文旨在研究乌梅等10味中药对产ESBLs大肠埃希菌的体外抑菌活性，为临床应用中药治疗耐药菌感染提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌均来源于新余市中医院门诊和住院患者的临床标本。分离培养按照《全国临床检验操作规程》第3版[7]进行，鉴定和药敏使用合肥恒星细菌鉴定和药敏分析仪。ESBLs的确证实验采用临床和实验室标准化研究所（CLSI）推荐的双纸片相邻试验（协同法）[8]。各收集至少10株经过确认的产ESBLs大肠埃希菌和非产ESBLs大肠埃希菌保存-20℃冰箱中备用。

1.2 标准菌株

大肠埃希菌ATCC25922，由温州康泰公司提供。

1.3 中药煎液的制备

十种中药乌梅、黄连、黄芩、黄柏、五倍子、穿心莲、重楼、金银花、鱼腥草、连翘均取自新余市中医院中药房。以乌梅为例。将100 g乌梅置于烧瓶中，加入5～8倍体积的蒸馏水，浸泡30 min，加热待其沸腾后调节火力大小使其微沸30 min，过滤将滤液倒入烧杯中。然后往烧杯中加入约3～5倍体积蒸馏水，加热煮沸，微沸30 min，过滤。合并两次滤液，并进行减压蒸馏，使药液体积达100 mL，即得到中药的水提浓缩液，浓度为1 000 mg/mL。灭菌后储存在-20℃冰箱中备用。

1.4 菌悬液的制备

挑取经过活化和纯培养18～24 h的菌落，用生理盐水调成0.5麦氏比浊单位（含菌量1.5×108 CFU/mL），再1∶10稀释，使其含菌量为1.5×107 CFU/mL，备用。

1.5 MIC测定

采用CLSI推荐的琼脂稀释法。

1.5.1 含药平板制备 取三角烧瓶10只，分别加入融化的MH琼脂25 mL，在第一只加入100%（1∶1）的中药煎液25 mL，使其浓度为500 mg/mL，混匀后取出25 mL，加入第二只烧瓶中，再混匀后取出25 mL加入第三只烧瓶中，依此类推，直到最终浓度为0.98 mg/mL，高压灭菌后倾倒平板待用。

1.5.2 琼脂稀释法 用上述配好的含药MH琼脂平板（含药量分别为500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL）进行实验。用微量移液器吸取1 μL含菌量为1.5×107 CFU/mL的菌悬液接种平板，最终接种菌量约每个接种点为104个菌。待菌液干后将平板倒置放35℃温箱培养18～24 h后观察结果，以肉眼观察无细菌生长的最低药物浓度为MIC。

经过实验，将对产ESBLs大肠埃希菌抑菌效果较明显的中药筛选出来，再对这些中药进行非产ESBLs大肠埃希菌的抑菌实验，记录MIC值。

1.6 统计学处理

使用SPSS13.0统计学软件分析处理，数据比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对产ESBLs大肠埃希菌抑菌效果较明显的是乌梅、五倍子、黄连、黄芩等4味中药，具体结果见表1、表2。

从表1可以看出，在较低含量药物水平下，依然对产ESBLs大肠埃希菌抑菌效果较明显的中药是乌梅、五倍子、黄连、黄芩。从表2可以看出，乌梅、五倍子、黄连、黄芩对产ESBLs大肠埃希菌MIC值在（15.63～62.50） mg/mL之间，平均MIC值分别为（17.19±4.94） mg/mL、（18.75±6.59） mg/mL、（37.50±10.21） mg/mL、（46.20±15.10） mg/mL，MIC90值分别是15.63 mg/mL、15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL。穿心莲、鱼腥草、黄柏、重楼、金银花、连翘等6味中药对产ESBLs大肠埃希菌也有一定的抑菌作用，但只有在较高浓度时才能抑制产ESBLs大肠埃希菌的生长。乌梅、五倍子、黄连、黄芩4味中药的MIC90值远低于穿心莲等6味中药的MIC90值，两者比较有显著性差异（t = 3.45，P < 0.05）。

乌梅、五倍子、黄连、黄芩对产ESBLs大肠埃希菌和非产酶大肠埃希菌的MIC值经统计学处理，无显著性差异（P > 0.05），结果见表3。

3 讨论

近年来，大肠埃希菌多重耐药株的大量出现，使临床对大肠埃希菌引起的感染治疗越来越困难，几乎到了无药可用的地步。ESBLs是指质粒介导的能赋予细菌对多类β-内酰胺类抗生素耐药的一类酶。由于质粒可在菌株间转移和传播，同时该酶有较广的水解底物谱，且部分产ESBLs菌株不但对β-内酰胺类抗生素耐药，而且还对氨基糖苷类、喹诺酮类等药物耐药，因此给临床抗感染治疗带来很大困难[9]。

国内外对于中药抗大肠埃希菌的报道较多，对产ESBLs大肠埃希菌株的中药研究较少。周雪宁等[10]对五倍子进行了体外抗产ESBLs大肠埃希菌的研究，并与清热解毒类的黄芩、黄连进行对比。结果显示，三种中药单味水煎剂对20株产ESBLs大肠埃希菌均有不同程度的抑菌作用，抑菌作用经方差检验有显著性差异，以五倍子效果最好。栾耀芳等[11]对黄芩等8种中药水煎剂采用琼脂稀释法，以临床收集的产ESBLs大肠埃希菌为实验组，同时以非产酶大肠埃希菌为对照组进行体外敏感性研究，观察各药物的最低杀菌浓度。结果显示黄芩对产酶大肠埃希菌的抗菌作用最好，黄连、大青叶次之，两组结果经统计学处理，差异无统计学意义。

我们用乌梅等10种中药对来自于临床的10株产ESBLs大肠埃希菌株进行体外抗菌活性筛选，结果发现这10种中药均有不同程度的抑菌活性，穿心莲、鱼腥草、黄柏、重楼、金银花、连翘只有在较高浓度时才能抑制产ESBLs大肠埃希菌的生长，而乌梅、五倍子、黄连、黄芩在较低浓度时就有抑菌作用。尤其是乌梅和五倍子水煎剂在低浓度时对产ESBLs大肠埃希菌的抑制作用最明显，是极具开发价值的抗产ESBLs大肠埃希菌的中药。

从乌梅、五倍子、黄连、黄芩对产ESBLs大肠埃希菌和非产酶大肠埃希菌的MIC值的比较可以看出，两组结果无显著性差异（P > 0.05）。中药对产酶和非产酶大肠埃希菌株的体外抑菌活性并无差异，说明中药的抗菌机制与抗生素存在不同。许多中药中不含酰胺环或成分复杂，ESBLs对其没有水解作用；中药中含有的一些特殊成分如五倍子中的鞣酸、黄连中的小檗碱等能抑制和干扰细菌的代谢；另外中药调节及提高机体免疫力的功能也在抗菌机制中起了相当重要的作用[12]。除此之外，关于中药的抑菌机制还有许多问题需要我们进一步研究探讨。

[参考文献]

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[11] 栾耀芳，张凤花，吴国英. 黄芩等8种中药对产β-内酰胺酶大肠埃希菌的敏感性研究[J]. 山东中医杂志，2005，24（10）：629-631.

[12] 杭永付，薛晓燕，方芸，等. 中药抗菌和逆转耐药作用机制研究进展[J]. 中国药房，2011，22（47）：4504-4507.

（收稿日期：2013-07-15）