浙贝乙素及其衍生物对豚鼠支气管平滑肌环磷酸腺苷的影响

【前言】浙贝乙素及其衍生物对豚鼠支气管平滑肌环磷酸腺苷的影响由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。笔者以浙贝乙索为先导化合物，进行结构改造和结构修饰，合成了3β-乙酰化浙贝乙素(PE-D1)、3β-丙酰化浙贝乙素(PE-D2)、3β-丁酰化浙贝乙素(PE-D3)、3β～苯甲酰化浙贝乙索(PE-D4)、氧化浙贝乙素(PE-D5)、3β-丁氧羰基化浙贝乙素(PE-D6)等6个浙贝乙素衍生物，经理化常数测...

摘要：目的：观察浙贝乙素及其衍生物对豚鼠支气管平滑肌内环磷酸腺苷(cAMP)水平的影响。方法：采用氧化铝柱层析法分离环磷酸朦苷(cAMP)，利用紫外分光光度法计算环磷酸腺苷(cAMP)的生成或消耗量来表示腺苷环化酶(AC)和磷酸二酷酶(PDE)的活力。结果：浙贝乙素衍生物各样品对腺苷环化酶(AC)的影响很低，对磷酸二酯酶(PDE)有抑制作用，从而提高环磷酸腺苷(cAMP)的水平。结论：浙贝乙素衍生物通过提高支气管平滑肌细胞内环磷酸腺苷的水平产生平喘作用。

关键词：浙贝乙素；衍生物；环磷酸腺苷；腺苷环化酶；磷酸二酯酶

中国分类号：R285.5

文献标识码：A 　文章编号：1673-7717(2007)12-2484-02

浙贝乙素(verticinone)是湖北贝母中的主要生物碱，其含量达生药材的0.3％，另外，贝母属植物中的另一主要生物碱浙贝甲素与浙贝乙素为酮和醇的关系，浙贝甲素很容易转变为浙贝乙素，两者含量之和占总生物碱含量的80％以上，两者提取分离方法在工业上也简单易行。药效学实验表明浙贝乙素具有较好的镇咳、祛痰、平喘之功效的结论，整体效果明显。因此，浙贝乙素含量高、活性较好、结构明确。

笔者以浙贝乙索为先导化合物，进行结构改造和结构修饰，合成了3β-乙酰化浙贝乙素(PE-D1)、3β-丙酰化浙贝乙素(PE-D2)、3β-丁酰化浙贝乙素(PE-D3)、3β～苯甲酰化浙贝乙索(PE-D4)、氧化浙贝乙素(PE-D5)、3β-丁氧羰基化浙贝乙素(PE-D6)等6个浙贝乙素衍生物，经理化常数测定及FAB-MS、H-NMR、DEPT等波谱技术分析及相关的化学反应，鉴定了它们的结构。在此基础上，笔者研究了浙贝乙素及其衍生物的镇咳、祛痰、平喘活性(衍生物编号PE～D1～6)。结果表明：(1)镇咳活性(3mg/kg)：PE-D1-6与阴性比较有显著性差异，且强于浙贝乙素；(2)祛痰活性(3mg/kg)：PE-D1与阴性比较有显著性差异。强于浙贝乙素。(3)平喘活性(3mg/kg)：PE-D1和PE-D3-6与阴性比较有显著性差异，其中PE-D1的平喘活性最强且明显强于浙贝乙素。结论：PE-D1(乙酰化浙贝乙素)具有很强的镇咳、祛痰、平喘活性，远强于浙贝乙素，整体效果明显，是一种很有开发前途的高效镇咳、祛痰、平喘药物。

环磷酸腺苷(cAMP)在支气管张力改变及预防高气道反应中具有重要作用。细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)的水平取决于腺苷环化酶(AC)和磷酸二酯酶(PDE)。本实验用氧化铝柱层析从各种核苷酸中分离CAIYLP，然后在260nm波长下测定吸光度来计算cAMP的生成或消耗量，表示AC或PDE的活力，从而研究浙贝乙素衍生物的平喘机理。

1.实验材料

浙贝乙素，由本课题组从湖北贝母中提取分离并鉴定，经HPLC测定纯度为99.17％；浙贝乙素衍生物，3β-乙酰化浙贝乙素(PE-D1)、3β-丙酰化浙贝乙素(PE-D2)、3β-丁酰化浙贝乙素(PE-D3)、3β-苯甲酰化浙贝乙素(PE-D4)、氧化浙贝乙素(PE-D5)、3β-丁氧羰基化浙贝乙素(PE-D6)均由本课题组合成并鉴定，经HPLC测定纯度均在98％以上；cAMP(SIGMA CHEMICAL CO.)，ATP(凌飞科技公司)；豚鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，体重200～250g；AC底物液的浓度为0.5mMATP，10mM NaF，33mM MgS04，50mM Tris-HCI缓冲溶液(pH7.4)；PDE底物液的浓度为lmM cAMP，33mM MgSO，50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)。在反应中研究药物的浓度为0.9mg/mL，药物用酶底物液稀释，在酶反应开始前加入酶底物液中。

2.标准曲线的制定

精密称取cAMP0.0041g，置于25mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容，配制成0.5nM的溶液，再分别精密吸取3.03、0.06、O.10、O.30、0.50、1.00mL该溶液于5mL容量瓶中并定容，用WFZ800-D3B紫外分光光度计测定各自的吸光度，结果见表1。

以吸光度(A)对cAMP的含量(x)回归，得回归方程为A=13.512X+0.0314，r=0.9999，吸光度(A)对cAMP含量(x)有直线关系。

3.实验方法

处死豚鼠，迅速取出气管支气管组织，用生理盐水洗去血液，保留肺门以下支气管组织，以1：10的比例，加入0.32M蔗糖溶液，在冰浴下匀浆，细胞达到完全破碎为止，匀浆液10000r/min离心15min，倾出上清液，沉淀物用上清液相等体积的0.32M的蔗糖溶液悬浮，分装后置-30℃下低温保存，两周内完成测定。

蛋白质浓度测定的方法为BCA法：(1)96孔板洗净泡酸后烘干备用；(2)取样品2μg/μL加入96孔中，每一样品平行上样3孔；标准的BSA 4μg/μL，购自Pierce公司；(3)将BCA试剂盒中A液和B液按50：1比例配置成工作液，将上述加样孔用工作液补至100μL；(4)37℃孵育30min；(5)酶标仪读出OD值；根据标准BSA用SPSS软件计算出OD值和蛋白质浓度之间的关系，然后计算出样品的蛋白质含量(表2)。

上清液主要为胞浆，用作PDE的活性分析，沉淀主要为膜组织，用作AC的活性分析。分别加上清液和沉淀悬液200μL于1.5mL的具塞塑料小离心管中，置37℃水浴中预温5min，然后上清液加入PDE底物液200μL，沉淀悬液中加入AC底物液200μL(底物液均在37℃下预温5min)，摇匀，立即置于37℃水浴中保温，上清液保温20min，沉淀悬液保温15min后取出置90℃水浴中3min以终止酶反应。对照管中先加入上清液或沉淀液，置90℃水浴中3min后再加PDE底物或AC底物。将各管离心，8000r/min 10min，取上清液分离cAMP。

称取活化的层析用氧化铝0.5g装入1cm×10cm的层析柱内，加入0.5mL0.05M Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗涤氧化铝柱，吸取离心后的上清液200pμL上氧化铝柱，待溶液进入柱内后，加入3mL0.05M Tris-HCl(pH7.4)缓冲液洗脱cAMP，通过氧化铝柱的洗脱液在260nm波长下测定其吸收度(A)。AC比活力以cAMP生成量来表示[nmol／(min・mg)蛋白质]；PDE的比活力以cAMP消耗量来表示[nmol／(min・mg)蛋白质]。处理结果见表3。

4.结果

从表3可知各样品对AC的影响很低即各样品对cAMP的生成没有太大影响，但PE-D1和PE-D3-6对PDE有明显的抑制作用，即对cAMP的降解有抑制作用，从而提高cAMP的水平。cAMP变化是抗哮喘药物药理活性的基础，凡提高细胞内cAMP水平的物质对哮喘的治疗均有裨益，与PE―D1和PE-D3-6平喘活性较好相平行。

5.讨论

环磷酸腺苷不但是重要的信使物质，而且可直接影响平滑肌的功能。在绝大多数情况下，平滑肌中cAMP含量升高可使平滑肌张力下降，反之则张力增高。许多资料表明，cAMP对于哮喘发病学有很大关系。植物神经对于细支气管紧张度和分泌的调节是由影响环核苷酸浓度的物质所调节的，哮喘中有关的各种细胞功能如嗜碱性白细胞、多形核中性白细胞、巨噬细胞和嗜酸性细胞等也受环核苷酸水平的变化调节。cAMP变化还是抗哮喘药物药理活性的基础，凡能提高细胞内cAMP水平的物质对于哮喘的治疗均有裨益，反之，凡是肯定的抗哮喘药物则能使分泌药理介质的细胞内cAMP水平增高或使受这些介质作用的细胞内cAMP水平提高。另外，当细胞内cAMP增加时，组织胺的释放受到抑制，当cAMP降低或cGMP增高时，则促进脱颗粒反应，高浓度的cAMP能稳定肥大细胞而防止脱颗粒。