LAMP方法在食源性副溶血性弧菌属检测的应用

【摘 要】目的：探讨副溶血性弧菌属（vibrio parahaemo lyticus， VP）环介导等温扩增（lamp）在食源性食物检测中的应用价值。方法：利用文献报道的LAMP检测方法和分离培养法分别对12类286份食源性食品标本进行副溶血性弧菌检测；检测结果经统计学分析来评价LAMP法和分离培养法的差异性。结果：LAMP法从64份动物性水产标本中检出44份副溶血性弧菌阳性菌株，阳性率为68.75%，电泳和加荧光染料染色后均能判断结果；国标法从64份动物性水产标本中检出33份副溶血性弧菌阳性菌株，阳性率为51.6%。两种方法的检测结果经统计学分析，P

【关键词】环介导等温扩增；副溶血性弧菌属；食源性；检测

【中图分类号】R155 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0555-02

随着生活水平的不断提高，食源性食物的安全越来越受到全社会和政府各级部门的高度重视与关注，而与食源性食物安全相关的微生物检测已成为食品保障的重要措施之一[1]。用LAMP法可以快速、简便、准确的检测出食源性食物中致病性微生物，大大缩短检测时间，提高致病性微生物的检出率，为致病性微生物的分离培养提供指导方向和科学依据。

副溶血性弧菌是引起人类急性胃肠炎和食物中毒的一种重要的食源性致病菌，在海水产品中其感染水平可达80%[2]，在细菌性食物中毒中，由副溶血性弧菌引起的居首位[3]。传统的副溶血性弧菌国标法[4]检测时间长，检出率低，不宜快速出结果。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术[7]是一种新型等温核酸扩增方法，针对靶基因设计4-6条引物，利用一种具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件 （60-65 ℃） 保温约 60 分钟，即可完成核酸扩增反应，产物为针对靶基因扩增产生的各种大小的茎环状DNA混合物，副产物为肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀。目前LAMP多侧重于检测方法的建立[8]，用于实际样品检测的研究较少。本实验室参加了国家食品风险安全监测，收集了12类286份食源性食品同时进行副溶血性弧菌国标法和LAMP法的检测对比，探究副溶血性弧菌属LAMP法在食源性食物检测中的实际应用价值，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 DYY-6C型电泳仪 （北京市六一仪器厂） ；凝胶成像仪 （Gel Doc 2000 BIO-RAD） ；DK-8D 电热恒温水槽 （上海精宏） ； Bst DNA 聚合酶 （Biolabs） ；Betaine （Fluka） ；MgSo4 （Sigma） ；SYBR Green I 、SYBR? Safe DNA Gel Stain （invitrogen） ；dNTP（北京天根公司）；通用型核酸提取试剂盒（广州华瑞安生物）；全自动微生物鉴定生化仪（美国BD）。干燥培养基购自广东环凯微生物科技有限公司，显色培养基购自法国CHROMagar公司， API生化鉴定卡购自法国生物梅里埃公司，均在有效期内使用。

1.2 标本来源 本科室2010年6月至12月收集的12类286份（生禽肉26份；生畜肉26份；熟肉制品32份；速冻熟制米面制品16份；速冻米面制品16份；即食非发酵豆制品26份；动物性水产64；沙拉16份；鲜榨果汁16；生食类蔬菜4份；冰激凌16份；婴幼儿配方食品16份）食源性食物标本；阳性控制菌株：副溶血性弧菌（ATCC-17802）。

1.3 食源性食品样品的前增菌 参照国标《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[4]进行处理。

1.4 LAMP检测食源性食品中的副溶血性弧菌 分别取1mL食源性食品标本前增菌液（3%氯化钠碱性蛋白胨水）10000 rpm离心2分钟，弃其上清液后，利用核酸通用提取试剂盒进行核酸提取，再取1μl上清液做待检模板DNA。利用文献[2，6]报道的LAMP检测方法及引物（F3：5'- GGCGATATTGGTGTTTATGGGG -3'，B3：5'- AACGATAAACTGGACCACGG-3'，FIP：5'- GACGACTGGTACTGATCGATAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGG -3'，BIP：5'- CCGGTGAAATTATCGCCACACAAAACCCACCGCCAGG -3'；由上海invitrogen公司合成。）对286份食源性食品标本增菌液DNA进行检测，反应体系（25μl）：FIP、BIP（40 uM）各1.0 μl，F3、B3（10 uM）各0.5 μl，10×Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μl，dNTP Mixture（10 mM） 3.5 μl，Betaine（5 M）5.0 μl，Mgso4（250mM）0.6 μl，Bst DNA 聚合酶 （8 U/μl）1. 0 μl，DNA 模板2μl，加ddH2o 至 25 μl。轻弹混匀后于水箱内65 ℃孵育60 min，80 ℃ 2分钟灭活酶结束LAMP反应。LAMP反应结束后可直接进行肉眼检测：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；也可将LAMP产物加荧光染料（1000×SYBR Green I）2 μl，1～5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性； 电泳鉴定：1μl扩增产物与0.2μl上样缓冲液混匀后点样于含适量SYBR? Safe DNA Gel Stain的2 %琼脂糖凝胶中，70 V电泳约60～100 min，电泳图片显示为最小片段大于100bp的LAMP特征性梯状条带，结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性；如见最小片段小于100bp的梯状条带，则判断为非特异性扩增，需要重新检测。

1.5 食源性食品中副溶血性弧菌的分离培养鉴定 参照国标《食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[8] 进行分离培养鉴定。

1.6 统计学方法 利用Pearson's卡方统计分析结果。

2 结果

2.1 食源性食品中的副溶血性弧菌LAMP检测结果 所有标本增菌液经LAMP法，仅从64份动物性水产标本中检测出副溶血性弧菌阳性菌株44份，阳性率为68.75%。并且可以通过肉眼判断：检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；也可将LAMP产物加荧光染料（1000×SYBR Green I）2 μl，1～5分钟后观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性，见图1。电泳检测结果，凝胶琼脂糖电泳出现最小片段大于100bp的LAMP特征性梯状条带为阳性，结果图2。

2.2食品中的副溶血性弧菌分离培养结果 所有标本经国标法，仅从64份动物性水产标本中分离出副溶血性弧菌阳性菌株33份，阳性率为51.6%。

2.3统计学分析结果 64份动物性水产标本经LAMP法和国标法，两种检测方法皆为阳性数：32份；两种检测方法皆为阴性数：19份；LAMP法阳性，而国标法为阴性数：12份；国标法为阳性，LAMP法为阴性数：1份；经Pearson's卡方统计分析，结果：P

3 讨论

本研究中利用LAMP法对食源性食品标本的前增菌液进行核酸检测，并和平行检测的国标法进行了检出率的比较，结果显示：LAMP法检出率更高，达68.75%，而国标法只有51.6%，两种检测结果经统计学分析，有统计学差异，LAMP法检测阳性率更高。

国标法需要经过增菌、分离、生化鉴定这几个步骤，检出副溶血性弧菌至需要4-7天。LAMP法检测只需要采用前增菌液进行核酸提取后即可开始LAMP扩增试验，在60分钟即可以完成LAMP扩增过程，24 小时内检出副溶血性弧菌属，相比国标法更快速。另外LAMP法还可以利用肉眼判断结果，直观方便，对于生鲜食品的快速检测具有重要的意义。

LAMP法是对副溶血性弧菌属的通用核酸检测，不能进一步鉴定分型和分离菌株，将LAMP法配合国标法进行食源性食品的卫生检测，LAMP检测发现阳性结果后再进行国标法试验来鉴定菌株，可以提高食品卫生检验的效率。

综上所述，在对食源性食物进行检测的过程中，运用LAMP快速检测方法，结合国标法，进行综合判断，可以在最短的时间内取得最准确的检验结果。

参考文献

[1] 张淑红，吴清平，张菊梅，等.显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用[J].微生物学通报，2006，33（6）：108-111

[2] 魏 明，廖成华.食用植物油掺伪的气相色谱检测方法研究[J].西南科技大学学报，2003，18（3）：57-60

[3] Wang S，Duan H，Zhang W，et al.. Analysis of bacterial foodborne disease outbreaks in China between 1994 and 2005[J].FEMS Immunol. Med. Microbiol. ，2007，51（1）：8-13.

[4] 中华人民共和国国家标准.GB/T4789.7-2008.食品卫生微生物学检验 副溶血性弧菌检验. 中华人民共和国卫生部， 2008-05-16.

[5] Cohen ND，Neibergs HL，Mcgruder ED，et al. Genus-specific detection of Salmonella using the polymerase chain reaction（ PCR）[J]. J Vet Diagn Invest ， 1993 ， 5（3） ：368-371

[6] 汪 琦， 张 昕， 张惠媛， 陈广全.利用PCR方法快速检测食品中的沙门菌[J]. 检验检疫科学，2005，15（6）：26-28.

[7] Notomi T，Okayama H， Masubuchi H， et a1. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res， 2000， 28（12） ：E63.

[8] 张如胜，宋克云，苏良，等. 环介导等温扩增技术快速检测副溶血性弧菌[J]. 国际检验医学杂志，2009，3： 217 - 219.

基金项目：

长沙市科技发展项目（K0902167-31）

作者简介：

袁洁（1968―），女，本科，副主任技师