LGT模型鼠血清及其癌组织提取液中蛋白质指纹比较研究

作者单位：030013 山西省肿瘤医院（陈妍，裴毅）；山西省忻州市人民医院（杜秀玉）

通讯作者：裴毅

【摘要】 目的 分析比较LGT模型鼠血清与其肿瘤组织中危重患者预警（LGT-Lost Goodwill Target）蛋白指纹的表达特征。方法 取4～5周龄雌性小鼠1只，接种S180肿瘤细胞悬液（0.2 ml/只），建立小鼠S180肉瘤动物模型。肿瘤细胞株S180以腹水瘤形式在昆明（KM）小鼠体内传代，传代后第8天，无菌条件下抽取腹水并以生理盐水稀释，调整细胞密度 2×107/ml，制成肿瘤悬液，置于冰浴备用。将制备好的肿瘤细胞悬液以每只0.2 ml于昆明小鼠（10只）右腋下的皮下接种造模。建立小鼠S180肉瘤动物模型。随机分为造模组（A组，5只）及对照组（B组，5只），肿瘤长至0.5 cm大小时，开始给予造模组（A组）腹腔注射顺铂5.2 mg/kg，连用4 d；同天给予空白对照组（B组）腹腔注射等计量生理盐水，连用4 d。于造模结束后第3天两组小鼠全部摘眼球取血，分离血清进SELDI 检测，解剖造模组小鼠，分别取瘤组织、瘤旁组织及正常组织各1 g，匀浆，抽取上清液行SELDI检查。并利用Biomarker Wizard 软件对各组血清及瘤组织、瘤旁组织及正常组织匀浆液的蛋白质组指纹图谱进行比较分析。结果 （1）A组血清LGT蛋白质组指纹阳性，B组血清LGT蛋白质指纹阴性。造模成功，A组可行进一步分析。（2）A组血清与癌组织液LGT相关蛋白质指纹图谱：有8个蛋白质差异有统计学意义（P

【关键词】 模型鼠； SELDI技术； LGT

The comparative analysis of the LGT protein fingerprints in model rat serum and cancerous tissue in model rat CHEN Yan， DU Xiu-yu，PEI Yi.Shanxi Tumor Hospital，Taiyuan 030013，China

【Abstract】 Objective To analyze and compare LGT model rat serum and tumor tissue LGT（LGT-Lost Goodwill Target）protein expression of fingerprint characteristics.Methods Take 4-5 weeks female mice 1 only，a mouse model was developed by inoculating S180 cells directly into KM mice.Tumor cell S180 with ascites tumor form in kunming （KM） mice nestin, the first eight days, after nestin under aseptic conditions and to extract ascites, adjust the diluted saline cell density 2×107/ml, make tumor levitation liquid, on the ice bath. Set aside. Will preparation good tumor cell suspension liquid per only 0.2 ml in Kunming mice （10） only right armpit subcutaneous inoculation made moulds. All the mice were divided into 2 groups. When the tumor long to 0.5 cm big hours ,group A was injected cisplatin 5.2 mg/（kg・d） for 4 days by intraperitoneal injection. Group B was control groups for 4 days by with group A of intraperitoneal injection with days such as measuring saline 4 days. The mice were killed at the fourth day after chemotherapy end. Then we collected the eyeball blood samples, and SELDI was applicated to test it. Made of module mice anatomy, were taken tumor tissue, peritumoral organization and normal tissue 1g each, use electric homogenate device homogenate, extraction supernatant fluid lines SELDI inspection. Respective proteomic fingerprint was analyzed by Biomarker Wizard software to discover the different proteomic fingerprints.Results （1）Group A serum LGT proteome fingerprint is positive, group B LGT serum protein fingerprint negative.（2）Group A serum protein with cancer organization fingerprint: In the detection of protein fingerprint: there are 9 protein difference was statistically significant （P

【Key words】 Model rat; SELDI-TOF-MS; LGT-Lost Goodwill Target

人类肿瘤蛋白质组的研究是目前恶性肿瘤研究的重要方法之一。裴毅等［1］于2004年应用SELDI技术从146例肿瘤患者在不同肿瘤情况下、不同病情发展阶段的动态血清蛋白质组的质谱中，捕捉到了一组促进肿瘤患者病情恶化的异常蛋白质组［2］，2005年通过省科技鉴定，认为蛋白质指纹是一个原创发现［3］。用SELDI证实该蛋白质指纹对肿瘤患者的病情演变和死亡发生有预警作用［4］。2007年完成表达LGT蛋白质动物模型的构建（鉴定专利：200710087535.7），证明了该蛋白质的存在［5］。

危重病人预警（LGT-Lost Goodwill Target）蛋白指纹模型鼠组及空白对照组，经SELDI技术分别检测小鼠的血清，造模组血清LGT蛋白质组指纹阳性，空白对照组血清LGT蛋白质指纹阴性。进一步对造模组小鼠瘤组织、瘤旁组织及正常组织匀浆后，匀浆液行SELDI检查，观察各组LGT蛋白质组指纹，并就其相关性进行比较。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 瘤源 S180肉瘤瘤株，由中国药品制品鉴定所引进。

1.1.2 实验动物 4～5周龄雌性昆明种（KM）小鼠，共10只，体重为19～22 g，购自于山西省肿瘤医院研究院动物实验室。

1.1.3 试剂和仪器 三氟乙酸、SPA、CHAPS、乙腈、尿素、Tris-HCI。ProteinChip Bioloy System（PBS）质谱仪、弱阳离子交换型（CM10）蛋白质芯片均购自Ciphergen Biosystems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 接种造模 取4～5周龄雌性小鼠1只，接种S180肿瘤细胞悬液（0.2 ml/只），建立小鼠S180肉瘤动物模型。肿瘤细胞株S180以腹水瘤形式在昆明（KM）小鼠体内传代，传代后第8天，无菌条件下抽取腹水并以生理盐水稀释，调整细胞密度 2×107/ml，制成肿瘤悬液，置于冰浴备用。将制备好的肿瘤细胞悬液以每只0.2 ml于昆明小鼠（10只）右腋下的皮下接种造模。

1.2.2 分组及给药方法 接种24 h后随机分组。分为两组：A组造模组（n5），腹腔注射顺铂5.2 mg/kg，连用4 d；B组空白对照组（n5），腹腔注射等计量生理盐水，连用4 d。

1.2.3 样品收集 于造模结束后第3天两组全部给予小鼠摘眼球取血分离血清进SELDI 检测，对造模组小鼠进行解剖，分别取瘤组织、瘤旁组织及正常组织各1 g，按0.5 g组织加入1 ml生理盐水，用电动匀浆器匀浆，3000 r/min离心5 min分离组织液，抽取上清液行SELDI检查。并利用Biomarker Wizard 软件对各组血清及瘤组织、瘤旁组织及正常组织匀浆液的蛋白质组指纹图谱进行比较分析。

1.2.4 血清样本的制备 将小鼠用2%戊巴比妥钠麻醉，摘眼球取血后，立即放入4 ℃冰箱静置30 min。随后4 ℃ 3000 r/min离心5min分离血清，分装，放入-80 ℃冰箱保存。使用时，冰上融化后，4 ℃ 10000 r/min离心5 min。在标记好的0.5 ml离心管中依次加入10 μl U 9缓冲液和5 μl 血清样品，并将样品混匀。稀释样品，冰浴振荡30 min，然后向15 μl稀释样品中加入185 μl醋酸钠缓冲液，用振荡器混匀。

1.2.5 组织上清液样本的制备 经SELDI技术分别检测小鼠的血清，造模组血清LGT蛋白质组指纹阳性，空白对照组血清LGT蛋白质指纹阴性。进一步对造模组小鼠瘤组织、瘤旁组织及正常组织匀浆后，匀浆液行SELDI检查。对造模组小鼠进行解剖，分别取瘤组织、瘤旁组织及正常组织1 g，将离体组织在半小时内，由专业技术人员行组织匀浆，按0.5 g组织加入1 ml生理盐水，用乳化匀浆机匀浆，随后4 ℃ 3000 r/min离心5 min分离组织液，抽取上清液，密封分装，放入-80 ℃冰箱保存。使用时，冰上融化后，4 ℃ 10000 r/ min离心5 min。在标记好的0.5 ml 离心管中依次加入10 μl U 9缓冲液和5 μl 血清样品，并将样品混匀。稀释样品，冰浴振荡30 min，然后向15 μl稀释样品中加入185 μl醋酸钠缓冲液，用振荡器混匀。

1.2.6 芯片预处理、上样和洗脱 将CM10芯片安装于加样器（bioprocessor） 内，向A-H 加样孔中加入200 μl 醋酸钠缓冲液，振荡5 min（ 600 rpm，室温），弃去缓冲液，重复上述操作1 次。向加样孔中加入100 μl 稀释血清样品，室温振荡孵育1 h（600 rpm，4 ℃）。弃去未结合样品，每孔加入200 μl 醋酸钠缓冲液，振荡5 min（ 600 rpm，室温），弃去缓冲液后，重复上述操作1 次。每孔加入200 μl清水（纯度HPLC级），重摇10次，立刻弃去。待芯片表面自然晾干后，每点各加饱和SPA 2次，每次1 μl，两次点样之间需待芯片表面风干后再次点样。自然干燥后，上机检测。

1.2.7 芯片检测、数据采集和参数设置 采用PBS-Ⅱc型蛋白芯片阅读仪读取芯片信息，用加有All-in-one标准蛋白质的NP20芯片校正仪器，至1%范围内。芯片阅读仪参数设置如下：激光强度195，检测灵敏度8，优化范围2000～20 000 kDa，最高分子量40 000，芯片上的每个点采集130 次。

1.3 统计学处理 所有数据采用Proteinchip Software 3.11进行统一校正，使总离子强度及分子量达到标准化。再利用Biomarker Wizard软件进行分析，所得数据以均数±标准差（x±s）表示，比较不同组的血清及癌组织蛋白质含量的P值，当P

2 结果

2.1 运用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪对各组间血清及组织液特异性蛋白质质谱图归类比较 将5例空白对照组、5例造模组，利用PBSⅡ型蛋白质芯片阅读仪对CM10芯片进行检测。检测的蛋白质分子量区间在1000～20 000 Da之间，所得到的蛋白质以波谱的形式表示（见图1、图2）。

2.2 运用Biomarker Wizard软件对各组间血清特异性蛋白质质谱图归类比较

2.2.1 比较造模组血清与癌组织液蛋白质指纹图谱 在检测出的蛋白质指纹图谱中：其中有8个蛋白质差异有统计学意义（P

表1 造模组血清与癌组织液蛋白质指纹差异

2.2.2 比较造模组血清与癌旁组织液蛋白质指纹图谱 在检测出的蛋白质指纹图谱中：其中有7个蛋白质差异有统计学意义（P

表2 造模组血清与癌旁组织液蛋白质指纹差异

2.2.3 比较造模组血清与正常组织液蛋白质指纹图谱 在检测出的蛋白质指纹图谱中：其中有5个蛋白质差异有统计学意义（P

表3 造模组血清与正常组织液蛋白质指纹差异

2.2.4 比较造模组血清与各组织液蛋白质指纹图谱 其中位于m/z：11 000+H～12 000+H的各组区分中被作为潜在的生物标记筛选了出来，从血清组、癌旁组织组、癌组织组到正常组织组，各组中的表达依次升高（见表4）：其中以正常组织液中LGT蛋白质相对含量最高，因此位于m/z：11000+H～12000+H的蛋白质在正常组织中为高表达。

表4 各组间各组LGT蛋白质相对含量

3 讨论

采用动物模型进行研究，可为进一步的人体研究提供有效的参数。SELDI蛋白芯片技术是目前国内外研究生命蛋白质组指纹学的主要设备之一。本研究是将这两种技术结合，分析比较动物模型血清与肿瘤组织中危重病人预警蛋白指纹的表达特征及相关指纹的表达特征。以明确该蛋白质是否存在于肿瘤组织中，以及与血清的差别。以肿瘤模型鼠大剂量化疗后，经SELDI技术检测模型鼠的血清，有LGT蛋白质组指纹出现，进一步对该组模型鼠瘤组织、瘤旁组织及正常组织匀浆后，匀浆液行SELDI检查，观察各组LGT蛋白质组指纹，并就其相关性进行比较。

前期的研究结果证明，LGT是客观存在的，是一个促进肿瘤患者病情恶化并导致死亡发生的重要蛋白质组。该蛋白质组可以借助于SELDI技术以指纹的形式进行描述。目前国内外对LGT研究较少，临床应用不多。通过进一步研究明确LGT指纹的发源地，揭示LGT出现和对机体产生影响的时机，这样就可为研发阻断药物找到靶点［6］，研发治疗药物，降低死亡率，为深入了解肿瘤的发生及发展过程和患者生前蛋白质组的变化提供科学依据。裴毅等于2007年成功地建立了产生该蛋白质的昆明鼠系动物模型［5］，并根据流行病学调查分析及临床应用研究，可以认为LGT蛋白质是客观存在的，而且其SELDI芯片技术捕获的LGT蛋白质指纹作为检验平台和抗肿瘤治疗疗效的判断，是有临床价值的［7］。

研究结果认为，危重病人预警蛋白质（LGT）不仅存在于血清中，还存在于组织、瘤旁组织及正常组织中，所不同的是其含量各不相同，其中两点最为重要：（1）各组中除LGT丰度含量不一样外，也表达其他差异蛋白质，说明在肿瘤生长过程中，各组织的其他生命活动依然存在。（2）正常组织中LGT蛋白质相对含量最高，表明肿瘤并不是直接造成机体病情恶化的原因，极有可能环境因素是肿瘤加重并导致死亡的主要原因，尤其是综合因素。本研究发现的各组织不相同蛋白质指纹，可以认为是因各组织的蛋白质代谢所致，但与LGT有无相关性有待进一步研究。

参考文献

［1］ 肖雪媛，卫秀平，何大澄.应用蛋白质芯片技术从血清中筛选肺癌标志蛋白.中国科学，2003，33（4）:323-338.

［2］ 裴毅.危重病人预警蛋白质动物模型的构建.国家专利,200710087535.7.

［3］ 王蓉,裴毅.危重病人预警蛋白质组指纹表达与无效化疗的相关性研究.现代生物医学进展,2007,7（12）:1856-1860.

［4］ 裴毅,郭素堂,王清馨,等.一组新发现的肿瘤功能性蛋白质的指纹图谱.肿瘤研究与临床,2005,17（3）:153.

［5］ 裴毅.标记恶性肿瘤预后的预警蛋白质组指纹特征的发现及认定.山西省科学技术厅.晋科鉴字［2005］第193号.2005,11.

［6］ Merchant M,Weinberger SR,Recent advancements in surface enhanced laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry.Electrophoresis,2000, 21（6）:1164.

［7］ 郑国宝,高春芳,赵光.利用蛋白质芯片（SELDI-TOF-MS）研究大肠癌患者血清蛋白特异性标记物//夏家辉.生命科学研究.北京：北京科学出版社,2003：76-80.

（收稿日期：2011-04-28）