颠茄托品烷生物碱合成途径基因表达分析与生物碱积累研究

[摘要] 托品烷类生物碱（tropane alkaloids， TAs）是临床上广泛使用的抗胆碱药物，颠茄是药典收录的TAs最主要的商业栽培药源植物。基于颠茄转录组测序数据构建TAs合成途径中9个结构基因（ODC，ADC，AIH，CPA，SPDS，PMT，CYP80F1，H6H，TRⅡ）UniGene序列的数字表达谱，采用qPCR对其中4个已报道基因（PMT，CYP80F1，H6H，TRⅡ）的表达水平进行验证分析，同时采用HPLC测定不同组织中TAs含量。数字表达谱分析结果表明4个TAs上游合成途径基因（ODC，ADC，AIH，CPA）和2个支路途径基因（SPDS，TRⅡ）在颠茄各器官中均有表达，但在须根中高水平表达；3个TAs合成途径特异的结构基因PMT，CYP80F1和H6H均只在须根中大量表达，主根中其次。qPCR检测PMT，CYP80F1，H6H，TRⅡ的表达结果与数字表达谱基本一致， 但PMT，CYP80F1，H6H在主根中表达量很低。莨菪碱质量分数在嫩茎中最高（3.364 mg・g-1），幼叶，根，幼果和果萼中其次（分别为1.526，1.598，1.271，1.413 mg・g-1）；东莨菪碱质量分数在果萼中最高（1.003 mg・g-1），嫩茎和幼叶（分别为0.600，0.601 mg・g-1）中其次；2种生物碱在老茎（莨菪碱0.283 mg・g-1，东莨菪碱0.043 mg・g-1）和老叶（莨菪碱0.313 mg・g-1，东莨菪碱0.080 mg・g-1）中质量分数均为最低。该研究结果表明须根是颠茄TAs 生物合成主要器官，而地上幼嫩组织是TAs主要存贮积累器官，TAs合成后存在转运过程。PMT下游基因均只在须根中表达，筛选颠茄须根的转录组数据库就可能为解决该途径中不清晰的合成步骤和相关转录调控因子提供有力的帮助。

[关键词] 颠茄；托品烷生物碱；数字表达谱；qPCR

[收稿日期] 2013-07-01

[基金项目] 教育部新世纪人才支持计划项目（NCET-12-0930）；国家高技术研究发展计划（863）项目（2011AA100605）；国家自然科学基金项目（31370333）；重庆市科技攻关项目（CSTC2012GGYYJS80013）；西南大学中央高校基本科研业务费专项（XDJK2013A024）

[通信作者] *廖志华，博士，教授，博士生导师，Tel：（023）68367146，E-mail：

[作者简介] 强玮，博士研究生，研究方向为植物生物学与生物技术，Tel：（023）68367146，E-mail：

托品烷类生物碱（tropane alkaloids， TAs）是一类具有巨大医疗价值的抗胆碱药物，广泛用于麻醉、镇痛、止咳、平喘和抗晕动病，也用于控制帕金森病的僵直和震颤[1]。临床上常用的是莨菪碱（hyoscyamine）和东莨菪碱（scopolamine），其中东莨菪碱毒副作用更弱，药效更强，价格也更昂贵，两者的市场需求均十分巨大[2]。目前TAs 都是从少数茄科TAs资源植物中提取，包括颠茄Atropa belladonna、曼陀罗Datura stramonium和莨菪Hyoscyamus niger，颠茄是东莨菪碱和莨菪碱最主要的商业栽培药源， 也是药典收录的TAs药源植物[3]。野生颠茄植株中莨菪碱质量分数为0.02%～0.17%（干重），东莨菪碱含量极低，仅为干重的0.01%～0.08%。因此，培育TAs高产颠茄一直是该行业长期追求的目标[2，4-5]。

随着对烟草、曼陀罗、莨菪等相关生物碱模式植物研究的深入，托品烷类生物碱合成途径已基本清晰（图1）。TAs生物合成以鸟氨酸和精氨酸为前体，分别经鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，OrnDC）直接脱羧或精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ArgDC）、精胺亚胺基水解酶（agmatine iminohydrolase， AIH）、N-甲氨酰基腐胺氨基水解酶（N-carbamoylputrescine amidohydrolase， CPA）的三步反应最终都形成腐胺。N-甲基-腐胺-转移酶（putrescine N-methyltransferase，PMT）与多胺合成途径的亚精胺合成酶（spermidine synthase， SPDS）竞争腐胺前体生成N-甲基-腐胺，将腐胺流从多胺代谢转向TAs合成，是TAs合成途径上的第一个限速步骤[6]。 N-甲基-腐胺经过一系列酶促和自发反应过程最终生成具有托品环结构的托品酮，托品酮继而被还原生成托品，然后与来源于苯丙氨酸的苯乳酸缩合生成海螺碱。从海螺碱到莨菪碱涉及到多步分子重排反应，CYP80F1是从莨菪中鉴定出来的参与其中反应的一个细胞色素家族基因[7]。莨菪碱6β-羟化酶（hyoscyamine 6β-hydroxylase，H6H）催化莨菪碱羟基化及环化两步反应，最终生成东莨菪碱，这也是东莨菪碱生物合成途径上最后一个限速步骤[8]。在TAs生物合成中，托品酮还原酶Ⅱ（tropinone reductase Ⅱ， TRⅡ）催化托品酮还原成假托品是最大的一个竞争支路途径，因为在野生颠茄中，该途径终产物打碗花精含量约是TAs的2倍[9]。

*.本文分析9个基因；实线箭头表示单一酶促反应步骤；虚线箭头表示多步酶促反应步骤。

图1 植物体内托品烷类生物碱生物合成途径

Fig.1 The biosynthetic pathway of TAs in planta

如上所述，尽管TAs生物合成途径脉络已基本阐明，但主要是基于对模式植物的研究，至今颠茄中也只有上游PMT和下游H6H基因得到了克隆并进行了生化分析。本文通过对新近完成的颠茄转录组数据库进行整合分析，绘制了上述9个基因EST序列的数字组织表达谱，并利用qRT-PCR技术对其中已的4个基因的组织表谱进行了验证，同时结合HPLC同步检测了相应组织中的莨菪碱和东莨菪碱含量，以全面了解颠茄TAs生物合成和存储积累，同时为解决该途径中不清晰的合成步骤和研究该途径的转录调控提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 颠茄 颠茄种子由西南大学生命科学学院“重庆市甘薯工程技术研究中心”保存，植株种植于西南大学温室。在颠茄生长花果期，从3株不同植株中分别采取根、老茎、嫩茎、老叶、幼叶、花、幼果和果萼共8个部位，40 ℃烘干研磨成粉，用于提取生物碱。绘制组织表达谱的材料则更加细致地采集11个器官的材料，依次为主根、须根、老叶、幼叶、嫩茎、花蕾、花瓣、花蕊、花萼、果萼和幼果，液氮速冻后-80 ℃保存用于提取RNA。

1.2 数字表达谱绘制 美国密歇根州立大学新近的药用植物基因组学资源网站（http：//medicinalplantgenomics.msu.edu/）完成了基于高通量测序的颠茄各组织/器官的转录组数据，EST序列经过充分组装后构建了UniGene转录组数据库，并进行了功能注释。登陆该网站搜索ODC，ADC，AIH，CPA，SPDS，PMT，TRII，CYP80F1，H6H共9个基因的所有UniGene序列，同时与烟草、曼陀罗和莨菪的相关同源基因进行blast比对，确保序列相似性在70%以上。基于基因表达丰度的FPKM（fragments per kilobase per transcript per million mapped reads）算法，作者同时获得了各UniGene在各组织/器官的FPKM值，以此为表达丰度作图，绘制各基因UniGene序列的数字表达谱。

1.3 总RNA提取及cDNA合成 总RNA提取使用TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit 试剂盒，紫外分光光度计测定其在260，280 nm处的吸光度，A260/A280均大于1.8小于2.1，表明RNA无蛋白和DNA污染。使用TaKaRa公司的PrimeScript？ RT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒将各器官的RNA进行反转录，得到cDNA第一链作为荧光定量PCR检测模板。加样体系：5×PrimeScript TMBuffer（for Real Time） 2 μL，PrimeScript TM RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer（50 μmol・L-1） 0.5 μL，Random 6 mers （100 μmol・L-1） 0.5 μL，总 RNA 1 μL，补足RNase Free H2O至10 μL，反转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.4 引物设计与 qPCR 根据NCBI上已公开的颠茄PMT，TRII，CYP80F1，H6H序列，使用Beacon designer软件设计qPCR引物（表1）。使用IQTM5 Multicolor Real-Time PCR 仪，参照SYBR？ Premix Ex TaqTM Ⅱ （perfect real time）试剂盒说明书进行qPCR反应。反应体系：2×SYBR Premix ExTaqTM10 μL，上游引物（10 μmol・L-1）0.8 μL，下游引物（10 μmol・L-1）0.8 μL，cDNA模板 0.5 μL，RNase-Free H2O 7.9 μL， 总体积20 μL。反应程序：95 ℃ 30 s，接着进行40个扩增循环（95 ℃ 5 s，退火 30 s，72 ℃ 20 s，延伸结束后采集荧光），退火温度见表1；融解曲线分析：60 ℃到95 ℃逐渐升温，每间隔0.5 ℃保温10 s，采集1次荧光。以PGK，ACTIN双基因作为内参，根据Pfaffl Method方法计算各基因的相对表达量。

表1 各基因qPCR引物

Table 1 primer pairs employed for the detection of expression levels

1.5 生物碱提取与 HPLC检测 颠茄各器官干粉参照Wang等发表的方法[2]提取托品烷生物碱用于HPLC检测莨菪碱和东莨菪碱含量，标准品均购至Sigema公司。HPLC检测使用岛津LC-60A高效液相色谱仪（泵 LC-6AD、柱温箱 CTO-10AS vp、控制器 SPD-20A），色谱柱为Phenomenex Gemini C18 110A液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.05 mol・L-1 pH 4.6醋酸胺缓冲液（流动相体系包含0.002 5 mol・L-1 SDS）（58∶42），流速1 mL・min-1，柱温箱40 ℃，检测波长226 nm，进样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 TAs合成途径基因数字表达谱 高通量转录组测序技术的发展为研究大基因组（>100 Mb）物种任何组织中的基因表达丰度提供了一个十分直接的方法，基于FPKM与RPKM等算法，可在宏观水平显示所有基因在组织/器官内和各基因在组织/器官间的表达差异。目前，颠茄11个组织/器官（主根、须根、茎、叶、花苞、花、幼果、成熟果、成熟种子、无菌幼苗和愈伤）转录组数据已公开，除了环境因素诱导表达的基因外，它基本包括了该物种所有表达的基因。本文以此为基础，绘制了颠茄TAs合成途径上9个基因UniGene序列的数字表达谱（图2）。有5个基因存在2条或多条UniGene， 表明可能是小基因家族，但是UniGene条数不代表基因家族成员数，本课题组克隆了CYP80F1基因全长cDNA，CYP80F1 1，3，4这3条UniGene其实是一个转录本的上中下游3个部位的小EST片段，其他可能也类似。TAs合成途径上游4个基因ODC，ADC，AIH，CPA在颠茄各器官均有表达，但在须根中的表达量基本都是最高，其中ODC有一个成员仅在须根和花苞异表达。2个支路途径基因SPDS和TRⅡ也在各器官均有表达，各UniGene在组织间表达量无太大差异。3个TAs合成的特异性结构基因PMT，CYP80F1和H6H只在根中表达，且须根中表达量都显著高于主根；H6H只在须根中有表达； CYP80F1有一个UniGene主要在主根和花中表达，须根和花苞中表达量微弱，其他器官不表达。

图2 颠茄TAs合成途径上9个基因的数字表达谱

Fig.2 Digital expression patterns of nine genes involved in tropane alkaloids biosynthesis in different tissues

2.2 4个已发表基因在不同器官中的表达 数字表达谱可以在宏观上呈现一个代谢通路上所有基因的表达模式，但是具体研究某些基因的表达量还需要qPCR验证。根据NCBI上公开的4个颠茄TAs合成基因序列（CYP80F1和TRⅡ为实验室克隆），设计qPCR引物，实验验证扩增效率均在90%～105%的有效统计范围内（表1），无引物二聚体，表明符合qPCR要求。采用双基因作为内参，根据Pfaffl Method方法计算各基因在颠茄11个器官的相对表达量（图3）。这4个基因表达结果与数字表达谱结果基本一致，PMT，CYP80F1，H6H都只在须根异性表达，主根中表达极低或根本不表达，表明这3个基因存在组织特异性；TRⅡ在各器官均有表达，且须根、老叶和花瓣中表达量最高。

图3 颠茄4个TAs合成基因的相对表达量

Fig.3 Relative expression level of four genes involved in tropane alkaloids biosynthesis in different tissues

2.3 不同器官中TAs含量 对颠茄各个器官中2种托品烷生物碱（莨菪碱和东莨菪碱）含量进行测定（n=3）（图4）。在所有检测器官中，莨菪碱相对于东莨菪碱都是主要生物碱，莨菪碱质量分数最高器官是嫩茎（3.364 mg・g-1），其次是根、幼叶、幼果和果萼（分别为1.598，1.526，1.271，1.413 mg・g-1），根中莨菪碱含量约是它们的2倍；东莨菪碱质量分数在果萼中（1.003 mg・g-1）最高，嫩茎和幼叶（分别为0.600，0.601 mg・g-1）中其次；在老茎（莨菪碱0.283 mg・g-1，东莨菪碱0.043 mg・g-1）和老叶（莨菪碱0.313 mg・g-1，东莨菪碱0.080 mg・g-1）中，莨菪碱和东莨菪碱质量分数都是最低的。总体而言，地上部位的幼嫩茎叶和果实是颠茄TAs含量积累最丰富的部位。

3 讨论

托品烷类生物碱（主要是莨菪碱和东莨菪碱）由于其显著临床药用价值和巨大市场需求，一直以来都是植物次生代谢领域研究的热点之一。目前，TAs生物合成途径已较为清晰，几个关键酶基因也得到了生化和转基因验证，这主要得益于对烟草、曼陀罗和莨菪等模式植物的研究。烟草虽然不能生产莨菪碱和东莨菪碱，但是其合成的尼古丁共享了TAs生物合成上游鸟氨酸、精氨酸到1-甲基-Δ-吡咯啉正离子的所有步骤。曼陀罗对于中游托品酮还原酶家族和苯乳酸来源支路途经的研究发挥了主要作用[10]，尽管参与该支路途径的基因仍还没有得到鉴定，但是已经否定了苯丙氨酸解氨酶PAL在TAs合成中的作用，同时也确定了是苯乳酸而不是托品酸参与了TAs的合成[11]。莨菪是研究下游H6H基因的绝佳材料，因为在莨菪中东莨菪碱是主要的托品烷生物碱，TAs合成途径上最近被鉴定出来的一个基因CYP80F1也是从莨菪中克隆[7]。颠茄作为我国法定TAs药源植物，其TAs合成途径研究已明显滞后，PMT和H6H作为该途径中公认限速酶，是唯一从颠茄中克隆到的2个基因。

图4 颠茄各个组织中TAs含量

Fig.4 Content of tropane alkaloids in different tissues

最近，颠茄转录组数据库完成并开放，本实验室陆续完成了其中TRⅡ和CYP80F1基因的克隆和验证（数据正在发表），结合该途径上其他基因的数字表达谱，颠茄中TAs生物合成进一步清晰。腐胺是广泛存在于植物体中的一种多胺，也是TAs合成的前体，合成腐胺的上游4个基因ODC，ADC，AIH，CPA连同亚精胺合成基因SPDS在颠茄各器官都有表达，因此属于初生代谢。PMT在联系初生代谢（多胺合成）和次生代谢（TAs合成）中起着枢纽作用，该基因和之后的CYP80F1和H6H均只在颠茄须根中大量表达，表明须根是TAs合成主要场所。支路途径的TRⅡ除了在须根中大量表达外，在茎叶中表达量也相当，由于打碗花精在植物体内的防御作用目前仅是假设，所以对于TRⅡ在根茎叶均高水平表达的结果有待进一步研究。

虽然须根是TAs合成主要部位，但是TAs含量最高的器官却是嫩茎、嫩叶和果萼，表明颠茄中生物碱存在转运过程。烟草中已经发现了若干个尼古丁转运蛋白[12]，大多数也能转运TAs， 生物碱转运蛋白研究是另一个热门的领域。幼嫩部位积累高浓度生物碱有其生理生态意义，对于防止食草动物和昆虫啃食幼嫩组织发挥着重要作用，同时对于颠茄采收也有指导意义。

在TAs合成途径上还存在3个值得探讨的问题，首先是腐胺合成的生源问题，鸟氨酸和精氨酸途径均能为多胺和TAs合成提供腐胺前体，但是对TAs合成起主要作用的途径仍有待研究。烟草中最新的研究发现干扰ODC表达能够显著减低尼古丁含量[13]，而反义干扰ADC的表达则没有太大效果[14]，表明鸟氨酸途径是参与尼古丁合成的主要途径。颠茄ODC数据表达谱表明存在一条在须根和花苞异表达的EST， 而ADC在各部位均有表达，强烈显示可能在须根中存在为TAs提供腐胺的特异鸟氨酸途径。其次是苯乳酸支路途径上酶基因的克隆，至今仍然没有突破，通过放射性同位素标记前体饲喂，已经在曼陀罗中确定苯乳酸、苯丙酮酸和苯乳酸能有效整合进莨菪碱的合成中[10]，但是参与该途径的基因克隆除了排除了PAL外一直没有进展[15]。最后一个问题是关于该途径转录调控，TAs合成途径是较早研究的一条次生代谢合成途径，虽然关于其次生代谢的研究仍然在各TAs资源植物中进行，但至今仍没有任何关于其转录调控和转录因子的报道，这相对于其他次生代谢途径如花色素苷、萜类吲哚类生物碱和青蒿素等已严重滞后。本研究从数字表达谱和qPCR均发现颠茄TAs合成途径特异结构基因PMT，CYP80F1，H6H均只在须根中大量表达，其他无组织特异性表达的基因也在须根中高水品表达，表明须根是TAs合成的主要场所，筛选颠茄须根转录组数据库就有可能确定上述两个问题的候选基因，为透彻认识和完善该生物合成途径提供新的思路和理论依据。

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Expression pattern of genes involved in tropane alkaloids biosynthesis

and tropane alkaloids accumulation in Atropa belladonna

QIANG Wei， WANG Ya-xiong， ZHANG Qiao-zhuo， LI Jin-di， XIA Ke， WU Neng-biao， LIAO Zhi-hua

（1.Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region of Ministry of Education，

School of Life Science， Chongqing 400715， China；

2.Chongqing Engineering Research Center for Sweetpotato，

School of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

[Abstract] Atropa belladonna is a medicinal plant and main commercial source of tropane alkaloids （TAs） including scopolamine and hyoscyamine， which are anticholine drugs widely used clinically. Based on the high throughput transcriptome sequencing results， the digital expression patterns of UniGenes representing 9 structural genes（ODC，ADC，AIH，CPA，SPDS，PMT，CYP80F1，H6H，TRII）involved in TAs biosynthesis were constructed， and simultaneously expression analysis of 4 released genes in NCBI（PMT，CYP80F1，H6H，TRII）for verification was performed using qPCR， as well as the TAs contents detection in 8 different tissues. Digital expression patterns results suggested that the 4 genes including ODC，ADC，AIH and CPA involved in the upstream pathway of TAs， and the 2 branch pathway genes including SPDS and TRII were found to be expressed in all the detected tissues with high expression level in secondary root. While the 3 TAs-pathway-specific genes including PMT，CYP80F1，H6H were only expressed in secondary roots and primary roots， mainly in secondary roots. The qPCR detection results of PMT，CYP80F1 and H6H were consistent with the digital expression patterns， but their expression levels in primary root were too low to be detected. The highest content of hyoscyamine was found in tender stems（3.364 mg・g-1）， followed by tender leaves（1.526 mg・g-1）， roots（1.598 mg・g-1）， young fruits（1.271 mg・g-1）and fruit sepals（1.413 mg・g-1）. The highest content of scopolamine was detected in fruit sepals（1.003 mg・g-1）， then followed by tender stems（0.600 mg・g-1） and tender leaves（0.601 mg・g-1）. Both old stems and old leaves had the lowest content of hyoscyamine and scopolamine. The gene expression profile and TAs accumulation indicated that TAs in Atropa belladonna were mainly biosynthesized in secondary root， and then transported and deposited in tender aerial parts. Screening Atropa belladonna secondary root transcriptome database will facilitate unveiling the unknown enzymatic reactions and the mechanisms of transcriptional control.

[Key words] Atropa belladonna； tropane alkalonids； digital expression pattern； qPCR

doi：10.4268/cjcmm20140111