荧光假单胞菌对食用菌生长的促进作用研究

摘要 研究荧光假单胞菌对食用菌生长的促进作用，结果表明：不同菌液对不同种食用菌香菇、平菇、鸡腿菇、白灵菇、双孢蘑菇、杏鲍菇的促生效果不同。在平菇、杏鲍菇、双孢蘑菇、鸡腿菇丝生长的共培养试验中，荧光假单胞菌的促进作用明显，以平菇最为显著。白灵菇菌丝生长的共培养试验中，没有观察到明显的促进作用。然而在香菇菌丝生长的共培养试验中发现显著的抑制作用。平菇出菇试验结果表明，添加菌液的菇袋，菌丝满袋时间较不添加菌液的对照提前5～8 d。原基分化、子实体形成也提前约1周的时间，同时出菇产量提高11.9%。

关键词 食用菌；荧光假单胞菌；16S rDNA鉴定；促生长作用

中图分类号 S646 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）02-0071-04

食用菌由于其独特的风味、丰富的营养和特殊的疗效，其鲜品和各种深加工产品符合人们的消费理念和生活追求，已经成为老百姓“菜篮子”的重要组成部分。以食用菌为主导的白色农业产业正成为新型效益农业的生力军。改造传统食用菌运作方式，发展现代设施化农业，形成具有区域特色的产业链，为农业增效、农民增收及农业现代化提供了强有力的技术支撑。目前，国内食用菌栽培料多经过巴氏杀菌、堆积发酵处理或采用生料[1]。在食用菌生长发育的不同时期，栽培料中微生物组成成分、种类及数量均随之变动[2-3]，在子实体形成时期荧光假单胞菌[4-5]数量达到峰值。研究结果表明，微生物的数量及组成对食用菌菌丝生长速度和子实体分化起着十分重要的作用[6-8]。

Kim et al报道过Pseudomonas sp.P7014对杏鲍菇菌丝生长及早期子实体形成的过程中所起的诱导作用[9]，并分别对其菌体和代谢物在促进菌丝生长方面的作用进行了研究，目的是利用此特点使杏鲍菇的产量提高，最终在商业领域开发和利用。鉴于此，该文利用此特点分离筛选产荧光的假单胞菌菌株，并将初步筛选到的菌株与平菇菌丝共培养，两者的共培养采取PDA平板共培养和在装有棉籽壳的试管里共培养的方法，初步研究其对平菇菌丝生长的影响，筛选出对平菇菌丝生长起促进作用的菌株，从而有效缩短平菇的生产周期，为进一步研究提高平菇产量积累了材料。同时，通过此次试验可以逐步考虑将平菇菌丝生长的促生菌制成微生物活菌制剂，有助于将来在商业领域的开发及其利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

郑州市平菇菌袋12个样：①长满菌丝并出菇；②菌袋一半长菌丝一半没长菌丝；③长满菌丝但未出菇；④菌袋两头长有少量菌丝。郑州市郊区不同的小麦和油菜地里取根际土，共18个土样。郑州市郊区双孢菇土样16个样：①长满菌丝的稻草；②覆土后接近菌丝的土样；③未长满菌丝的稻草；④覆土后接近菌丝的土样。安徽文昌西扎村桃源取根际土样共14个样。共取样60个，所有材料的采集采用无菌操作，采集后分别放入无菌袋，4 ℃冷藏保存。

1.2 试验方法

1.2.1 产荧光菌株的初筛及纯化分离。对于前12个样分别取菌袋的表面和深层培养料少许放入含90 mL无菌水的三角瓶中，置摇床振荡15～20 min，使微生物细胞分散，静置20～30 s，即成10-1的悬液。对后面几个土样则按土壤稀释液的制备方法称取10 g进行稀释。

采用平板稀释法[10]将所取材料用无菌水以10倍梯度稀释成10-4～10-1 稀释液，取10-4～10-1稀释液各0.2 mL涂MS平板（或King′s B培养基），28 ℃培养 48 h，检查分离结果，挑取单个菌落并划线分离，纯化培养，直至用显微镜涂片染色检查为单一微生物为止，同时将初筛到的菌进行相应编号并保存，平菇菌袋里筛选到的菌编号为（1～25），小麦和油菜地里筛选到的菌编号为（a～y），双孢菇培养料里筛选到的菌编号为（A～T），西扎村桃源取根际土样筛选到的菌编号为（26），将所筛选到的菌做简单鉴定，观察菌落形态、颜色、菌落大小及产荧光色素的情况。挑取366 nm波长紫外光下发绿色荧光的菌落纯化培养并保存。

1.2.2 荧光假单胞菌生理生化特性鉴定试验[11-12]。一是筛选试验复筛优选出促进生长作用显著的3种菌株。平板及试管待筛细菌与平菇菌丝共培养试验。平菇菌种的活化[1]所筛选菌株与平菇菌丝共培养采取以下2种方式：① PDA平板试验。取初筛分离纯化后保存的菌株转管活化于28 ℃恒温箱中培养24 h，然后接入装有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的500 mL三角瓶中，置于28 ℃、220 r/mim摇床振荡培养24 h，得到培养好的饱和细菌菌液。按无菌操作要求将菌液分别用无菌水稀释到10-1和10-2后，各吸取0.2 mL对号接入已写好稀释度的PDA平板中，每个号码设3个重复，用无菌玻璃涂棒涂布均匀涂布平板上，用直径1 cm打孔器从长满平菇菌丝平板上获取相同接种量的菌丝块，将其与平菇菌丝共培养，放于涂好菌的平板中央。对照组PDA平板中加入0.2 mL的无菌水和菌丝块。接种后置于28 ℃培养箱中恒温培养，以后每天观察菌丝生长状况，并记录结果。②试管试验。取初筛分离纯化后保存的菌株转管活化于28 ℃恒温箱中培养24 h，然后接入装有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的500 mL三角瓶中，置于28 ℃、220 r/mim摇床振荡培养24 h，得到培养好的饱和细菌菌液。按无菌操作要求将菌液分别用无菌水稀释到10-1和10-2后，各吸取0.2 mL对号接入已写好稀释度的大试管中。棉籽壳装试管的1/3，测其pH值为6.9，每个号码设3个重复，用直径1 cm打孔器从长满平菇菌丝平板上获取相同接种量的菌丝块将其与平菇菌丝共培养，在装有棉籽壳（料水比1∶1.1，添加1%石灰和1%石膏）的试管（18 mm×180 mm）里将两者共培养，对照组大试管中加入0.2 mL的无菌水和菌丝块。接种后置于28 ℃培养箱中恒温培养，以后每天观察菌种生长状况，同时每隔2 d画圈1次，并记录结果。将平板试验与试管试验筛出的促进菌丝生长效果显著的3种（O、b、22）菌株挑选出来，保存于4 ℃冰箱中。

二是微生物拮抗作用试验。采用琼脂块扩散法[12]，将用于作拮抗菌的菌株涂布接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，28 ℃培养3 d，然后用1.0 cm的打孔器打孔，制成琼脂块备用，对照用未接种的琼脂块。再将用作被拮抗菌的菌株涂布接种于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，然后将制备的琼脂块小心地放在平板上，于28 ℃培养3 d，观察拮抗菌对被拮抗菌的拮抗作用。

三是杏鲍菇、白灵菇、双孢蘑菇、香菇与菌液体的共培养试管试验及平板试验。取复筛分离纯化后保存的菌株O、b、22转管活化于28 ℃恒温箱中培养24 h，然后分别接入装有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的500 mL三角瓶中培养基，置于28 ℃、220 r/min摇床振荡培养24 h，得到培养好的饱和细菌菌液。杏鲍菇、白灵菇、双孢蘑菇、香菇菌种转到PDA平板上活化。在统一规格大试管中添加等量棉籽壳（料水比1∶1.1，添加1%石灰和1%石膏）。双孢菇培养基采用1/2双孢菇菌糠、1/2棉籽壳。用直径1 cm打孔器从长满天达-300菌丝平板上获取相同接种量的菌丝块，将菌丝块放入试管中同时加入1 mL菌液，对照分别添加1 mL无菌水和1 mL NBY培养基。每个处理3个重复，置于28 ℃培养箱中恒温培养，以后每天观察菌丝生长状况，并按时记录观测结果。

四是平菇出菇试验[1]。将平板试验与试管试验筛出的促进菌丝生长效果显著的3个菌株做平菇出菇试验。取复筛优选后保存的菌株转管活化于28 ℃恒温箱中培养24 h，然后接入装有100 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，置于28 ℃、220 r/min摇床振荡培养24 h，得到培养好的饱和细菌菌液。在统一规格栽培袋中装入等量的栽培料，灭菌2 h后冷却至30 ℃左右时接入10 g平菇栽培种同时分别取10 mL培养菌液加入菇袋中。用无菌水作为空白对照，每个处理6次重复记录试验结果，出菇时间及菇产量。

五是16S rDNA鉴定[13-14]。利用PCR 技术，从细菌总DNA中扩增其16S rDNA基因。PCR 产物纯化后与pGEM-T载体连接，连接产物转入E.coli DH5a感受态细胞。经蓝白斑筛选，获得含16S rDNA基因的重组质粒的转化子。从E.coli DH5a中提取含16S rDNA基因的质粒，测序。由Invitrogen公司完成，测序用引物为F341，R518。将所得的部分长度16S rDNA 序列187 bp（GenBank登陆号：ICL15321）与GenBank中核酸数据进行BIAST分析，生成发育树。

2 结果与分析

2.1 荧光假单胞菌的初步筛选结果

前17个样筛选时使用MS培养基，在260 nm紫外光下观察荧光的结果并不理想，但在改用KB培养基后，将前17个样中初筛到的菌株再培养并在260 nm紫外灯下观察时有12株菌有明显的荧光出现，如图1所示。荧光假单胞菌在KB培养基上表现为优势种，产生水溶性黄绿色荧光色素，可扩散到周围培养基中，使培养基呈色，如图2所示。后43个样筛选时用King′s B培养基直接筛选到78株发荧光的菌，经纯化分离初步鉴定为荧光假单胞菌，需要做进一步的测定才能证实。从上述各处分离得到的菌体单克隆1 017个，从中挑选出形态差异显著且产荧光的假单胞菌共70株，保留这些菌株（分离自平菇栽培料、根际土及双孢蘑菇栽培料的菌株编号分别为1-25、a-y、A-T），以待进一步鉴定。

2.2 筛选试验复筛优选出促进作用显著的3种菌株

2.2.1 平板上共培养结果。初筛得到的70株菌株，置于28 ℃、220 r/min摇床振荡培养24 h，取培养菌液0.2 mL涂布平板上，用直径1 cm打孔器从长满平菇菌丝平板上获取相同接种量的菌丝块将其与平菇菌丝共培养，发现两者在平板上共培养的结果并不理想，共培养组中的平菇菌丝并没有比对照组长得快，反而出现不同程度的抑制现象，共培养组中的菌丝在平板上的长势，如图3所示。

2.2.2 试管里共培养结果。初步筛选的70株菌株置于28 ℃、220 r/min摇床振荡培养24 h，取培养菌液0.2 mL，分别将菌液与平菇菌丝块（用直径1 cm打孔器从长满平菇菌丝平板上获取相同接种量的菌丝块）共培养于装有等量棉籽壳的统一规格（30 mm×200 mm）大试管里，发现初步筛选的62株菌株对平菇菌丝生长均有不同程度的促进作用，如图4所示。试验开始的2 d时间对照与共培养的平菇菌丝几乎没有明显差别，之后的1周逐渐呈现显著差异。从中优选出促进平菇菌丝生长效果最显著的3种菌株O、b、22。

2.3 微生物拮抗作用试验

如表1所示，O、b对其他菌株均不存在拮抗作用，T、m和25分别对M和22菌株存在拮抗作用。而M对其他9株菌株中除b外的8株菌株都存在拮抗作用。O、b、22 3种筛选出的促进生长作用显著的菌株之间均不存在拮抗作用，可考虑期间复配混合发酵。

2.4 形态观察及生理生化特性试验

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》[15]所列假单胞菌属内特征对菌株进行了一系列的生理生化分析，O、b、22 3株菌株具有共性：革兰氏染色呈阴性；培养物产生可扩散的荧光色素；能利用海藻糖；不产类胡萝卜素和脓青素，4 ℃生长，41 ℃不生长，28 ℃为最适温度，可以利用柠檬酸盐，对青霉素不敏感，氧化酶阳性，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阳性、明胶液化阳性、水解淀粉阴性。菌株间差异表现在果聚糖产生、反硝化、酯酶（Tween 80）等鉴定特征。基本可认为3个菌株均为荧光假单胞菌。

2.5 杏鲍菇、白灵菇、双孢蘑菇、香菇与菌液体的共培养试管试验及平板试验

试验结果表明：细菌菌液（37 ℃）对杏鲍菇的促进作用显著，对白灵菇、香菇菌丝生长有抑制作用，在香菇生长过程中抑制作用尤为显著，如图5、图6、图7、表2所示。这表明，同种细菌对不同种类食用菌菌丝生长影响不同，不同种类细菌对同一种类食用菌的影响作用及程度也有差异。

2.6 平菇出菇试验

试验结果表明，添加菌液的菇袋菌丝满袋时间，出菇时间均明显缩短1周左右，结果如表3所示。添加菌液的菇袋菌丝平均生长速率均较CK有明显提高，菌丝平均生长速率最快的是菌株b，是CK的1.88倍，与此同时添加菌液的菇袋产量亦提高了11.9%。

2.7 16S rDNA鉴定

荧光假单胞菌P2-10 16S rDNA部分序列的测定结果已提交GenBank 核酸序列数据库，登陆号是ICL15321。将该序列与GenBank 核酸序列数据库中报道的12株不同种荧光假单胞菌菌株的16S rDNA部分序列利用DNAMAN Alignment 软件进行比较，得到系统进化树，从进化树可以看出，分离筛选得到的食用菌高效促生荧光假单胞菌P2-10与其他荧光假单胞菌的相似度范围在94%～97%，其中与P.citronellolis DSM 50332T 和P.nitroreducens PS-2 二菌株的相似度最高，达到97%，如图8所示。

3 结论与讨论

分离筛选并经16S rDNA鉴定的荧光假单胞菌对平菇菌丝生长促进作用显著，且能使原基分化和子实体形成时间提前5～8 d同时出菇产量亦提高11.9%。韩国Kim et al[9]报道过Pseudomonas sp.P7014（假单胞菌的一种）对杏鲍菇菌丝生长的促进作用（两者共培养于PDA平板上）与对照相比菌丝生长速度可达到对照的1.6倍，促进作用很明显。此次试验也证实某些细菌对食用菌菌丝生长有促进作用；所筛选分离的细菌菌液与平菇菌丝在试管上共培养的结果促进平菇菌丝生长作用明显。不同种细菌菌液促进生长作用的程度不同，据此优选出3株效果最显著的菌株O、b、22。经形态观察、生理生化鉴定，结合16S rDNA鉴定均为荧光假单胞菌。荧光假单胞菌对杏鲍菇、白灵菇、双孢蘑菇、鸡腿蘑、香菇菌丝生长的影响作用结果迥然不同。进行平菇出菇试验，记录出菇时间和蘑菇产量，以进一步探讨荧光假单胞菌促进食用菌生长的作用机理。平菇出菇试验结果表明：添加菌液的菇袋，菌丝满袋时间均较不添加菌液的对照提前5～8 d。原基分化、子实体形成也提前约1周时间，同时出菇产量亦有提高。

该研究为商业化生产一种促进食用菌生长发育的活菌制剂提供了良好的契机，有针对性地筛选促生长效果显著的细菌是关键。促进生长作用机理尚有待于进一步深入研究，菌株之间的互配、培养条件的优化等对于提高食用菌产量、增收增效很有益处和研究价值。

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