实时荧光RT

作者：李振勇，邵大晓，冯艳铭，李智涛，景建洲，王云龙，屈凌波，赵玉芬

【关键词】 ,SARS病毒

Realtime fluorescent RTPCR quantitative detection of SARS CoV in serum of infected patients

【Abstract】 AIM: To detect SARSCoV in various clinical specimens such as sputum, gargling liquid, throat swab and stool and explore the association between the disease course and the SARSCoV content. METHODS: We quantitatively detected 156 serum specimens from SARS patients by real time RTPCR. The viral load in SARSCoV positive serum was analyzed using the coronavirus deactivated with 9.4×109 copies/L. Robert Koch Institute as standard preparation and viruslike particles as positive controls. RESULTS: The sensitivity of the detected agent was 1×105 copies/L. Eightyone of the 156 cases (51.9%) tested were positive with the viral load ranging from 1×105-1×107 copies/L. The viral load in serum samples was generally low as compared with data reported for other specimens. CONCLUSION: There is no significant relationship between the low viral load and the disease course.

【Keywords】 RTPCR； SARS CoV； quantitative diagnosis； serum

【摘要】 目的：阐述SARS患者病程与血清中SARS病毒含量间的关系. 方法：采用高灵敏度荧光实时定量RTPCR方法，对156份SARS患者进行检测，同时，以9.4×109 copies/L（Robert Koch Institute）灭活的SARS冠状病毒为定量标准品，病毒样颗粒为阳性对照，分析SARSCoV阳性血清样本中的病毒含量. 结果：检测试剂的灵敏度达1×105 copise/L，与相关病原体没有交叉. 81份血清样本中病毒含量分布在1×105～1×107 copies/L之间，患者血清样本中病毒含量较低，经统计学分析，病毒含量与病程长短无明显数量关系. 结论：SARS患者血清中病毒含量低，与病程没有明显的相关性.

【关键词】 SARS病毒；逆转录聚合酶链反应；定量分析；血清

0引言

冠状病毒严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）［1］，主要通过近距离密切接触传播. 从各种样本中检测SARSCoV非常重要，不仅能更好地治疗，而且能早期有效地控制疾病传播. 采用定量RTPCR方法对患者痰液、漱口液、咽拭子和粪便中SARSCoV RNA进行检测，证明了这些样本中病毒含量很高，具有传染性［2,3］. 而患者血液样本中阳性检出非常少. 20030516 WHO报道血液样本中有SARSCoV存在，提示人们SARS病毒可能存在病毒血症. Ng等［4］报道了以血清/浆检测SARSCoV是早期检测的重要手段. 我们通过对156份来自于临床患者的血清样本进行检测、定量分析，探讨不同病程与血清中SARS病毒含量间的关系，为进一步研究SARS血症提供依据.

1材料和方法

1.1材料

标准品由德国柏林Robert Koch Institute的Matthias Niedrig先生惠赠，灭活病毒含量为9.4×109 copies/L；抗核酸酶SARS病毒样白颗粒悬浮液（本实验室自制）［5］，浓度为1.8×1013 copies/L. SARS荧光PCR定量检测试剂盒由华美生物工程公司提供. SARS患者血清156份来自于小汤山、北京地坛等医院的-70℃储存的样本，临床诊断符合卫生部标准. 甲肝、乙肝、丙肝、戊肝、庚肝，TTV，HIV,巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体、肺炎支原体阳性标本和正常人血清、人基因组DNA来源于华美生物工程公司PCR室. 使用美国PE公司的PE7700荧光扩增仪. SARS荧光定量PCR试剂盒由华美生物工程公司生产. 荧光PCR检测的靶序列选择在病毒RNA聚合酶基因上，该区域极为保守［6］. 使用的PCR引物和探针分别为SARSUP：5′cgcaagtattaagtgagatggtc3′；SARSLP 5′aagcagttgta gcatcaccg3′. 荧光探针： 5′FAMgcggctcactata tgttaaaccaggtggaaTAMRA3′.

1.2方法

血清样本的处理、RNA反转录、荧光PCR检测和结果判读均按照试剂盒说明书进行操作. 采用试剂盒中提供的5×105，5×106，5×107和5×108 copies/L的血清稀释病毒样颗粒构建标准曲线. 阴性对照为正常人血清，以正常人血清稀释的抗核酸酶SARS病毒样白颗粒悬浮液为阳性对照. 为了确认定量的精确程度，检测WHO建议的灭活SARS冠状病毒标准参考品样品. 该样品起始浓度为9.4×109 copies/L，用正常人血清进行10倍稀释，以各个稀释度为样本，通过定量试剂盒构建的标准曲线进行定量检测，并重复3次.表1SARS患者5例血清病毒含量变化（略）

2结果

2.1灵敏度和特异性将5×107 copies/L血清标准样品稀释到1×105，5×104 copies/L，并以此为样本用荧光定量试剂盒重复检测50次，其检测的Ct值分别为31.247，32.685，阳性检出率分别为100％，80％. 因此试剂盒分析灵敏度为1×105 copies/L. 以肝炎甲、乙、丙、戊、庚以及TTV，HIV，巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、沙眼衣原体，肺炎支原体阳性标本、正常人血清和人基因组DNA为模板进行PCR检测，其Ct值均为40，结果应判为阴性，特异性良好.

2.2PCR定量标准曲线以试剂盒中提供的5×105，5×106，5×107及5×108 copies/L血清样本为标样，经过两次重复的全过程PCR反应和荧光检测，Ct值分别为28.457，25.124，22.208和18.607，获得了反应的动力学曲线（Fig 1），其中阳性对照和阴性对照的Ct值分别为24.200和40.00，检测结果极具重现性. 由于模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数是线性关系［3］，拷贝数与Ct值成反比. 根据PCR检测的Ct值和标样的模板起始拷贝数，由计算机软件做标准曲线，其中横坐标代表每个样本起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（Fig 2）. 其中标准曲线的斜率为-3.266，相关系数1.0. 因此，只要获得待检样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数. 将WHO建议的灭活SARS冠状病毒标准品用正常人血清稀释成不同浓度，用定量试剂盒构建的定量曲线进行定量分析，统计分析显示实际测定的浓度与稀释后理论数值间相关系数（Correl）为0.998，表明定量体系准确.

2.3血清样本的定量检测将156份非典患者血清样本、正常人血清（阴性对照）和阳性对照，在PE7700扩增仪上进行了荧光定量检测，结果81例为阳性，阳性率51.9％. 并根据其标准曲线、Ct值，给出每个PCR阳性样品的起始病毒含量.

由81例SARS阳性样本的研究表明，SARS病毒在血清中出现的时间，随着个体差异而不同，最短出现的病程是3 d，最长的病程达到158 d仍然有病毒存在. 所有阳性的血清标本的SARS病毒含量均在1×105～1×107 copies/L（Tab 1），病毒含量与病程的长短并没有明显的数量关系（相关性分析Correl=-0.22758）. 在检测标本中对7，4，30，3，11号血清样本进行追检，收集了不同病程的样本，经检测有3例患者血液中SARS病毒先为阳性，后转为阴性，患者病情好转. 2例患者血液中SARS病毒先为阴性，后转为阳性（Tab 1）.

3讨论

由于SARS的特殊性，需要对患者进行早期诊断，因此，对于SARSCoV的检测试剂盒灵敏度显得非常重要. 我们为了检验试剂盒的灵敏度，我们将定量的标准品稀释到5×104 copies/L，阳性检出率为80％，1×105 copies/L时，阳性检出率为100％. 说明试剂盒在临床检测中，当病毒含量在5×104～1×105 copies/L是检测的灰区，需要重复检测方可确认. 另外，用多种病原体核酸和人基因组核酸及正常人血清进一步验证了试剂盒的特异性. 事实上，该试剂盒检测的靶序列选在SARS多聚酶基因的15330～15416(BJ01,AY 278488) 保守区，并对引物、探针和整个系统进行全面优化，从而达到高灵敏度和特异性，给SARS回顾性研究提供了有力工具.

从研究结果可知，81例血清阳性样本的病毒滴度范围在1×105～1×107 copies/L，和杨洁等［7］报道的痰液样本中高病毒含量（1×1011 copies/L）相差甚远，预示SARS冠状病毒可能与呼吸道疾病有关. 至于病毒血症较长的原因，有待进一步研究.

通过对5例有不同时期抽血的患者标本检测，有3例患者血液中SARS病毒先为阳性，后转为阴性，这类病例可能是由于患者住院后，随着治疗的过程，患者病情逐渐好转，血清中病毒逐渐被免疫系统清除. 2例患者血液中SARS病毒先为阴性，后转为阳性，而SARS抗体检测表现出同样的模式，是否存在临床早期诊断误判或住院后感染？为何会出现这种血清模式尚有待进一步的研究. SARS病毒在血清中存在，说明了血液具有传染性，因此，从事SARS患者血液操作要严加防护，曾患有SARS或近期曾接触SARS患者，避免义务献血，这些措施可有效地阻断SARS的传播. 另外，在研究结果中，血清中病毒存在的时间从发病后3 d到发病后158 d，证实了SARS病毒的血症期很长，提示人们在SARS检测、治疗和预防中，应该引起足够重视.

【参考文献】

［1］ Ng ML, Tan SH, See EE, et al. Entry and early events of severe acute respiratory syndrome coronavirus ［J］. J Med Virol, 2003; 71:323-331.

［2］ Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith CS, et al. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome ［J］. N Engl J Med, 2003; 348:1953-1966.

［3］ rosten C, Gunther S, Preiser W, et al. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome ［J］. N Engl J Med, 2003; 348:1967-1976.

［4］ Ng EK, Hui DS, Chan KC, et al. Quantitative analysis and prognostic implication of SARS coronavirus RNA in the plasma and serum of patients with severe acute respiratory syndrome ［J］. Clin Chem, 2003; 49(12):1976-1980.

［5］ 李振勇，景建洲，刘明霞，等. 含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达［J］. 第四军医大学学报，2004；25（20）：1858-1861.

Li ZY, Jing JZ, Liu MX, et al. Construction and expression of viruslike particles containing SARS CoV RNA ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004; 25(20): 1858-1861.

［6］ Marra MA, Jones SJ, Astell CR, et al. The genome sequence of the SARSassociated coronavirus ［J］. Science, 2003; 300:1399-1404.

［7］ 杨洁,王战会,陈金军，等. SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立［J］. 第一军医大学学报,2003;23(5)：424-427.

Yang J, Wang ZH, Chen JJ, et al. Clinical detection of polymerase gene of SARSassociated coronavirus ［J］. J First Mil Med Univ, 2003; 23(5): 424-427.