HSV复制与细胞周期蛋白关系的研究进展

〔摘要〕目的单纯疱疹病毒是目前研究病毒与宿主相互作用的重要模型。过去曾一度认为HSV复制与细胞周期蛋白没有太大关系,近几年的研究证明并非如此。HSV复制不仅需要细胞周期相关蛋白,而且已经进化到能诱导静止细胞产生细胞周期相关蛋白,为HSV服务。CDK抑制剂正在作为抗病毒药物进行积极的研发。

〔关键词〕HSV;CDK;细胞周期蛋白;CDK抑制剂

〔中图分类号〕R373〔文献标识码〕A〔文章编号〕1009-6019-(2010)04-81-04

单纯疱疹病毒(herpessimplexviruses,HSV)是最早被发现的疱疹病毒,也是被研究最深入的病毒之一,但对其生物学特性仍然不很清楚。HSV的最主要的特征是其与宿主细胞的相互作用复杂并且为保持长期生存有着双重的生命周期〔1〕。由于其与宿主细胞复杂的相互作用,HSV已成为研究蛋白质的转位、神经系统中突触连接、膜结构、真核基因的表达调节、基因治疗、病毒与宿主细胞相互作用及其他生物学问题的重要模型和工具〔2〕。本文就近年来HSV复制与细胞周期蛋白的关系的研究进展进行综述。

1HSV概况

HSV属于α疱疹病毒科,包括HSV-1和HSV-2两种,以HSV-1为代表(以下简称为HSV)。HSV是大型的有包膜的双螺旋DNA蛋白,基因组全长约152kb,GC含量占68%以上。HSV基因组为一线性双链DNA分子,由共价连接的长片段(L)和短片段(S)组成,两者分别占病毒DNA的82%和18%,每一片段由中间的独特序列(分别称为UL和US)和两端的倒置重复序列(RL和RS)组成。HSV基因组共约含有74个基因,编码近90种蛋白质。根据其动力学性质可将HSV病毒基因分为立即早期基因(immediate-early,IE或α),早期基因(early,E或β)和晚期基因(late,L或γ)3类〔3〕。HSV感染包括增殖性感染和潜伏性感染两种,除引起皮肤和粘膜的疱疹样病变外,还能引起诸如中枢神经系统、呼吸系统、生殖器官以及流产、死胎和肿瘤等多种疾病〔3〕。

2HSV与细胞周期

在正常的情况下,周期中细胞分为分裂期(M期)和分裂间期,分裂间期包括Gl、S、G2等3个时期。细胞仅在S期含有DNA半保留复制所需的代谢底物、酶和蛋白因子,因此不编码大部分DNA复制所需蛋白的DNA病毒纷纷采取独特的策略克服这一变化的核环境问题。小DNA病毒采取的生存策略就是当被感染的细胞进入S期、条件合适时再复制其病毒DNA〔4〕。对比之下,象HSV这样的大DNA病毒,不仅能在分裂细胞中繁殖,而且还能在静止细胞及终末分化的神经细胞中繁殖,因此长期以来一直认为大DNA病毒复制与细胞周期相关蛋白无关。但近年来的研究发现,HSV复制不仅需要细胞周期相关蛋白,而且己进化到能诱导静止细胞产生细胞周期相关蛋白,HSV感染后诱导宿主细胞停滞于细胞周期某一特定时相,抑制宿主细胞DNA合成,抑制细胞凋亡,但支持HSVDNA的复制,完全为HSV服务。

2.1HSV感染引起细胞周期阻滞1988年deBruyn和Knipe用原位杂交技术确凿的证明HSV感染引起细胞DNA合成的抑制〔5〕。人们认为这种DNA合成的阻滞是因为HSV感染使细胞周期阻滞于G1/S期检验点导致的。流式细胞仪分析表明HSV感染的确能引起细胞周期阻滞,G1期细胞增加。Dargan等用无DNA的HSV蛋白感染细胞也能引起细胞周期阻滞,且并不导致细胞凋亡。说明不是因为HSVDNA的合成导致细胞周期阻滞的,是HSV外壳蛋白对细胞周期相关因子起到了抑制作用。多项研究综合表明是HSV中的ICPO和ICP27蛋白的作用引起的细胞周期阻滞〔6〕。

HSV具有高度的易感性,其宿主细胞广泛,能感染分裂期或非分裂期细胞,是较理想的基因治疗载体。HSV能引起细胞周期阻滞某种程度上说是对细胞有一定毒性作用的。鉴于这种细胞周期的阻滞作用是由于ICPO、ICP27引起的,基于ICPO/ICP27的基因表达载体构建对于病毒的基因治疗将有重要意义。

HSV既能在静止细胞也能在周期细胞中繁殖,而且本身还编码DNA聚合酶等复制相关蛋白,HSV感染使细胞周期阻滞是否是为了本身的繁殖目前还不清楚。有报道说细胞组蛋白与HSVDNA结合会抑制病毒DNA的复制和转录〔7〕。也有人认为细胞周期阻滞是宿主对抗病毒的一种平衡。我们更倾向于认为是由于HSV对细胞代谢的改变亦即通过抑制细胞DNA的合成,减少原料、细胞因子的浪费,而使细胞被动的停滞在G1/S期检验点。

2.2HSV复制需要细胞周期相关蛋白的活性曾一度认为HSV复制不需要细胞周期相关蛋白。但研究发现,HSV在周期细胞中的复制效率远远高于静止细胞,HSV虽然编码DNA聚合酶等DNA合成相关蛋白,但不编码拓扑异构酶、DNA连接酶,而且可在病毒复制蛋白缺乏的条件下复制,那么此时HSVDNA复制蛋白只能由宿主细胞来提供。而HSV感染能引起细胞周期阻滞在并不表达这些酶和蛋白的G1期,并且HSVDNA得到复制,说明HSV可能诱导了S期相关蛋白在Gl期的表达。这就促使人们研究HSV细胞周期相关因子在HSV繁殖中的作用。

早在1978年Yanagi等研究发现,HSV不能在非允许温度下阻滞于G1期的温度敏感型幼仓鼠肾细胞(tsBHK)突变株tsAF8中繁殖,但能在允许和非允许温度下阻滞于S期的tsBHK突变株tsHJ4中繁殖。对这一结果最简单的解释就是HSV复制需要S期相关蛋白。后经一系列的实验证实tsAF8中编码细胞周期相关蛋白HCF-l(Themammaliantranscriptionalcoactivatorhostcellfactor-1)的基因发生了突变,亦即细胞周期的重要调节因子HCF是HSV繁殖所必需。现证明HCF与oct-1及间层蛋白V16结合作用于立即早期基因增强子核心序列TATGRAT上促进立早基因的转录〔8〕。

E2F是促进Gl/S期以及S期相关基因转录的主要转录激活因子,关于E2F在HSV感染细胞中活性变化的报道结果不一。有报道说HSV感染后代表GO/G1期特征的抑制性复合物E2F/pRb、E2F/p107增加,许多依赖转录因子E2F的S期相关基因转录下降〔9〕。ICP4、ICP27功能缺陷型HSV感染宿主细胞后不能引起E2F以及S期标志物EZF/p107活性的升高。说明可能是HSV中ICP4、ICP27蛋白起到了诱导宿主细胞E2F基因表达的作用。Song等的结果进一步证明抑制性复合物E2F/pRb和E2F/p107增加是由于HSV中ICP4、ICP27、ICP0的作用结果。因此认为E2F以及S期标志物E2F/p107可能在HSV基因复制和转录中起重要作用。

与正常细胞的Gl期不同,许多S期相关蛋白存在于HSV感染的处于G1期的细胞中。这种HSV能独立于细胞周期而诱导细胞S期基因表达但使细胞呈G1期状态,说明HSV能改变多种细胞周期相关蛋白的活性,为HSV复制服务。HSV与细胞周期有着广泛的相互作用,尽管详细的作用蛋白和作用机理尚未阐明,各家观点不一,但对这些研究进行综合所得出的一般结论是:HSV复制与细胞周期密切相关,细胞周期相关蛋白在HSV复制中起重要作用。其中细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclindependentkinases,CDK)是HSV繁殖所必需。

3CDK在HSV复制中的作用机制

CDK:周期蛋白依赖性蛋白激酶,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,它只有与相应的细胞周期蛋白(cyclin)结合后才有活性。1998年Shang等对很多抑制细胞周期相关蛋白、细胞某些信号转导途径抑制剂的抗病毒作用的筛选结果表明,只有能抑制CDK1、2、5、7的药理学CDKs抑制剂(pharmacologicalCDKSinhibitors,PCI)Roscovitine能抑制HSV的复制,此抑制作用发生于对细胞周期的抑制之前,且PCI对HSV的抑制程度与其对CDK的抑制程度相关〔10〕。也就是说不是细胞周期的阻滞,而是CDK活性的抑制使HSV基因的转录以及DNA的复制不能进行,说明了CDK在病毒复制中的重要性。

3.1CDK可能通过促进RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化而促进HSV基因转录的起始Roscovitine抑制HSV的转录可能是通过抑制起到转录调节作用的CDK进行的。RNA聚合酶Ⅱ在转录起始前先要形成转录起始前复合物,然后其羧基末端结构域(carboxyl-terminaldomain,CTD)被CDK7等磷酸化从而使RNA聚合酶Ⅱ从转录起始前复合物中释放出来起始转录。在转录过程中RNA聚合酶Ⅱ的CTD进一步被CDK9磷酸化。CDK1、2也参与RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化〔11〕。因此CDK活性的抑制可能影响到RNA聚合酶ⅡCTD的磷酸化从而抑制HSV基因的转录起始。体外提取HSV感染的细胞核,用Run-On实验证明Roscovitine能抑制HSV立即早期基因转录的起始,在转录起始后加入能抑制CDK1、2、5、7的Roscovitine并不影响HSV立即早期转录本的量,说明Roscovitine对转录的延长过程没有作用,只是抑制转录的起始。参与转录延长的是CDK9,CDK5的功能不涉及转录,而CDK1仅在HSV感染后期起作用。那么可能是CDK2、7是HSV转录起始所必需的。

3.2CDK可能通过影响HSV染色体的构象而促进HSV基因转录起始复合物的组装Roscovitine能抑制HSV基因的转录但对细胞基因的转录没有影响,甚至在Roscovitine存在下细胞转录本的量更多。说明可能Roscovitine并不是单纯通过抑制依赖于CDK的RNA聚合酶Ⅱ的CTD而抑制HSV基因的转录的。由于Roscovitine抑制基因的转录与启动子无关〔12〕,我们推论CDK可能通过影响HSV染色体的构象而影响HSV基因的转录。目前支持这一推论的实验还不多。我们的初步实验也发现:未用Roscovitine处理的转录活跃的HSV基因组能被DNA酶水解成弥漫状,而用Roscovitine处理的HSV基因组能够抵抗DNA酶的水解。说明Roscovitine处理和非处理的HSV染色体构象不同,CDK的确对HSV染色体的构象有影响。有学者研究,只要HSV启动子结合了各种转录因子及RNA聚合酶形成了转录起始前复合物,HSV基因的转录就不受Roscovitine的影响。说明Roscovitine并没有作用于HSV转录的起始过程,而是影响了HSV染色体的活化阻止了转录起始前复合物在HSV启动子上的组装从而抑制了HSV基因的转录。亦即CDK可能通过促进HSV染色体的活化而促进了HSV基因的转录。

3.3CDK可能通过使HSv调控蛋白磷酸化而促进HSV基因的转录蛋白质的磷酸化是调控蛋白质生物活性的重要方式。HSV基因组中仅编码两种蛋白激酶(UL13,US13)〔13〕,不能满足HSV调节蛋白磷酸化的需要。因此细胞蛋白激酶在通过磷酸化调控HSV蛋白中起重要作用,其中CDK可能通过促进HSV调控蛋白的磷酸化而促进HSV基因的转录和DNA的复制。

ICPO和ICP4是调控HSV基因转录的主要蛋白。Roizman等发现Roscovitine能抑制ICP0和ICP4的磷酸化。Davido等发现在Roscovitine存在下ICP0的电泳特性不同亦即ICP0的结构有所不同,Roscovitine影响了ICPO的转录后加工过程。进一步发现在Roscovitine存在下ICPO对早期基因ICP6转录激活作用大大下降。这一结果与前述Roscovitine即使在立即早期蛋白得到表达仍然能够抑制HSV早期基因的转录的结果一致,立即早期蛋白必须经过CDK的修饰活化才能促进早期基因的转录。

综上,与小的DNA病毒类似,HSV的复制也与细胞周期密切相关。HSV在周期细胞中的复制速度远远大于静止细胞。HSV感染引起细胞周期阻滞但诱导了细胞周期相关蛋白的表达和活性以促进HSV的的复制。CDK可能通过通过促进RNA聚合酶CTD的磷酸化、影响HSV染色体的构象、使HSV调控蛋白以及细胞蛋白的磷酸化等多种机制促进HSV基因的转录和DNA的复制。

4展望

目前发现能被PCI抑制的病毒越来越多,亦即众多的病毒的复制或转录都需要CDK〔14〕。说明CDK2在病毒复制中作用的普遍性。CDK似乎是病毒与宿主细胞抗衡的的焦点。因此CDK抑制剂正在作为抗病毒药物进行积极的研发中,PCI作为抗肿瘤药已进入临床二期实验阶段。虽然自从1998年首次发现PCI能抑制HSV的繁殖以来,关于PCI抗病毒作用的研究较多,但是具体哪种CDK在HSV繁殖中起作用,在HSV感染的哪一阶段起作用所知不多。正像过去HSV是研究真核生物转录机理及调控的模型一样,目前HSV也成了研究病毒于宿主细胞相互作用以及抗病毒药物研制开发的重要模型。深入研究CDK与HSV复制的关系将会对HSV以及其他重要疾病病毒在细胞内的活动过程有更清晰的认识,同时对PCI作为抗病毒药的研发具有重要意义。

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〔收稿日期:2010-04-30〕