内质网分子伴侣GRP94在瘢痕疙瘩中的表达

[摘要]目的：观察内质网分子伴侣grp94在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达，探讨GRP94在瘢痕疙瘩发生中的作用。方法：用免疫组织化学法和免疫印迹法分别检测12例瘢痕疙瘩与12例正常皮肤组织中GRP94的表达。结果：①GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织的角质形成细胞、成纤维细胞、炎症细胞、血管内皮细胞以及毛囊、汗腺、皮脂腺等细胞质及少数细胞的核中表达。②表皮中GRP94的表达量在两种组织无显著性差异（P>0.05）；真皮中GRP94阳性成纤维细胞数在瘢痕疙瘩组明显高于（1283.33±565.10/mm2）正常皮肤组（238.33±255.62/mm2），（P

[关键词]内质网；GRP94；瘢痕疙瘩

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2007）09-1184-02

Expression of endoplasmic reticulum molecular chaperone GRP94 in Keloid

NIE Fang-fei,CHEN Dong-ming，ZHAO Xia，SUN Dong-jie

（Department of Plastic Surgery, the Third Hospital of Pecking University, Beijing 100083,China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between GRP94 and keloid by detecting the expression of GRP94 protein in keloid and normal skin tissue.MethodsImmunohistochemistry staining and western blotting were used in 12 cases of keloid and 12 cases of normal skin tissue. Results①GRP94 mainly expressed in cytoplasm,partially anchored in nucleus of keratinocytes，fibroblasts，inflamatary cells and endothelial cells.Hair follicles,sweat glands and sebaceous glands were also stained positively. ②Although the expression level of GRP94 between the two groups in epidermis was no significant difference（P>0.05）. The positively stained fibroblast cell number in dermis was found significantly increased in keloid group(1283.33±565.10/mm2）, compared with normal skin group(238.33±255.62/mm2)（P

Key words: endoplasmic reticulum;GRP94;keloid

瘢痕疙瘩是瘢痕形成机制的代表性病变[1]，是以胶原过度沉积于真皮和皮下组织为特征的皮肤胶原性疾病，表现为过度生长，超出原损伤范围，侵犯邻近组织，呈瘤样增生，是整形外科面临的难题之一。葡萄糖调节蛋白94（glucose-related protein 94，GRP94）属于内质网分子伴侣，参与内质网应激反应。GRP94与肿瘤、炎症、自身免疫病等多种疾病相关[2]。瘢痕疙瘩的发生类似于良性肿瘤[1]，本研究通过检测瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中GRP94蛋白的表达，探讨GRP94在瘢痕疙瘩形成过程中的作用。

1材料和方法

1.1 标本来源： 所用标本均来自本科手术的患者，瘢痕疙瘩12例，其中男性3例，女性9例；患者年龄21～52岁，平均38.2岁；正常皮肤12例，其中男性4例，女性8例，患者年龄21～67岁，平均40.8岁，为整形美容手术弃用的皮肤。所有取材均获得患者知情同意，取材前均未经药物治疗，且取材部位无破溃、感染、肿瘤等其他疾病。标本取材后，迅速在液氮中冻存。

1.2 主要试剂： 兔抗人GRP94多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、兔抗人Actin多克隆抗体（Santa Cruz，美国）、ECL Plus 发光液（Amersham , 美国）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗、免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司）。

1.3 免疫组织化学染色： 冰冻切片6μm，4℃丙酮固定10h。采用SP免疫组化试剂盒染色，DAB显色试剂盒显色，操作步骤按照试剂盒说明书进行。一抗（GRP94多抗）稀释度为1:300，以PBS代替一抗作阴性对照。阳性为胞质或胞核棕黄色着色，阴性不着色。

免疫组化染色结果的数据采集： 表皮GRP94＋角质形成细胞着色强度的评估：用CMIAS2001B病理图像采集分析系统对两组标本进行图像采集，每例标本在放大400倍的条件下采集5个不重叠视野，测定平均光密度值，计算每组平均值，反映GRP94的表达。

真皮中GRP94＋成纤维细胞的计数： 用武汉产目镜带格式显微测微尺，在放大400倍的条件下，每例样本检测10个视野，分别计数各例标本真皮层中阳性成纤维细胞的数目。

计算公式为：细胞数/mm2＝细胞总数÷视野数（10）÷格式目镜测微尺的面积（0.005mm2）。

1.4 免疫印迹实验：取手术切下的皮肤组织，保留表皮，用三去污裂解液提取总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取20μg总蛋白溶液，与5×SDS上样缓冲液混匀，沸水浴变性5min，10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳80V×2h，电转膜70V×2h，5％脱脂奶粉封闭3h，一抗（GRP94多抗，1:200；Actin多抗，1:500）孵育，4℃过夜，二抗孵育（1:5000）1h，ECL plus暗处显色5min，X光胶片曝光、显影、定影。

免疫印迹实验结果的数据采集： 英国Syngene凝胶成像分析系统扫描分析GRP94和Actin条带的灰度值，两者比值代表每例样本GRP94的相对含量。

1.5统计学处理：每组病例平均光密度值、细胞计数或蛋白表达相对含量的数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验作组间比较，P

2结果

2.1 GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的表达部位：GRP94主要在角质形成细胞、成纤维细胞、炎症细胞和血管内皮细胞及皮肤附属器的毛囊、汗腺、皮脂腺的胞浆表达，在两组中均可见GRP94在少数细胞的胞核中表达（图1～3）。

2.2 GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织表达量的变化：免疫组化结果显示GRP94在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织表皮的表达量无显著性差异，P>0.05（表1）；在真皮中，瘢痕疙瘩GRP94阳性成纤维细胞数多于正常皮肤组，P

3讨论

在高温、缺氧、饥饿等各种应激作用下机体细胞可以通过诱导特异性蛋白的产生（包括HSP和GRP等）对环境及生理应激产生应答。葡萄糖调节蛋白(glucose-regulated protein，GRP)是在应激状态下细胞内质网明显表达的一类应激蛋白。GRP94位于内质网腔、细胞表面等，是内质网应激的标志分子之一，具有多种重要的生物学功能[2]。本实验中GRP94蛋白主要在皮肤组织的角质形成细胞、成纤维细胞、炎症细胞、血管内皮细胞以及皮肤附属器的毛囊、汗腺、皮脂腺的胞浆表达，在各组中均可见少数细胞的胞核中也有表达。该结果与GRP94在少数食管癌[3]、肝癌[4]等细胞的核中表达的报道相类似，其表达的意义尚待进一步的研究。

有文献报道GRP94的表达与食管鳞癌、结肠癌、肝癌的分化、发展、血管浸润及转移存在明确的关系，分化越低GRP94表达水平越高[4-6]。可能与GRP94能抵抗低氧诱导的细胞凋亡，增强肿瘤细胞的存活能力[7]有关。GRP94的表达水平与肿瘤细胞的增殖和侵袭能力都呈一定的正相关。瘢痕疙瘩局部组织处于低氧[8]，具有长时间不能自行消退的生物学特征（类似于肿瘤样改变）[1]，本实验GRP94在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达量明显高于正常皮肤，提示瘢痕疙瘩组织低氧等应激因素引起的成纤维细胞发生内质网应激反应是瘢痕疙瘩中GRP94高表达的诱因，同时过度表达的GRP94抵抗细胞凋亡，导致细胞增殖旺盛，造成了局部低氧的微环境，如此恶性循环可能是瘢痕疙瘩不断增生的原因所在。与肿瘤侵袭力正相关的GRP94的高表达可能是引发瘢痕疙瘩组织超过原损伤部位向周边正常组织浸润的机制之一。

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[收稿日期]2007-05-11 [修回日期]2007-08-13

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