益气除痰方对肺癌移植鼠内质网分子伴侣蛋白GRP94表达的影响

摘要：目的 观察益气除痰方对脾虚Lewis肺癌移植鼠内质网分子伴侣蛋白GRP94表达的影响，探讨其抗癌的可能作用机制。方法 采用苦寒泻下加饥饱失常方式建立脾虚小鼠模型，再将无血清培养基制备的癌细胞悬液接种至脾虚C57BL/6小鼠背侧，制作脾虚Lewis肺癌小鼠模型。将48只成模小鼠随机分为模型组、化疗组、联合用药组及益气除痰方低、中、高剂量组，每组8只。各给药组给予相应药物干预。给药14 d后处死小鼠，检测肿瘤体积和质量；HE染色观察各组移植瘤组织形态，免疫组化、Western blot和RT-PCR检测肿瘤组织GRP94蛋白和基因表达。结果 与模型组比较，化疗组、联合用药组及益气除痰方中、高剂量组肿瘤体积、肿瘤质量明显降低（P

关键词：益气除痰方；肺癌；脾虚证；GRP94；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0059-05

Effects of Yiqi Chutan Formula on GRP94 of Endoplasmic Reticulum Molecular Chaperone in Mice with Lung Cancer WEI Yu-lin， WANG Shu-mei， LIU Qi-ou （Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of Yiqi Chutan Formula on expression of GRP94 of endoplasmic reticulum molecular chaperone in mice with lung cancer. Methods The binding methods of diarrhea of bitter and cold and abnormal of starvaion were used to establish spleen-deficiency mice models. Cancer cell suspension prepared by serum-free medium was inoculated to the back of C57BL/6 mice to establish spleen-deficiency Lewis lung cancer models. 48 successfully modeling spleen-deficiency Lewis lung cancer mice were randomly divided into model group， chemotherapy group， Yiqi Chutan Formula low-， medium-， and high-dose groups， and combined medication group， with 8 mice in each group. Each medication group was intervened with relevant medicine. The mice were killed after 14 days of medication. The size and weight of tumor in mice were measured； morphological changes of transplanted tumor were observed by HE staining method； the protein and gene expressions of GRP94 in tumor tissues were tested by immunohistochemistry， Western blot and real-time fluorescence quantitative PCR. Results Compared with model group， the tumor volume and weight of chemotherapy group， Yiqi Chutan Formula medium- and high-dose groups， and combined medication group decreased significantly （P

Key words： Yiqi Chutan Formula； lung cancer； spleen-deficiency syndrome； GRP94； mice

基金项目：重庆市科委课题（cstc2013jcyjA10092）

通讯作者：王淑美，E-mail：

肺癌属中医学“肺积”“息贲”“肺痈”等范畴，中医病机特点为本虚标实。中医理论认为，肺癌的发病多因正气先虚，邪毒乘虚而入，致肺气郁，肃降无权，加之脾虚运化失司，痰浊内生而成，故肺癌的治疗首选益气除痰。益气除痰方是由党参、白术、茯苓、生半夏、山慈菇、蟾酥等中药组成。方中党参、生半夏宣肺健脾，白术、茯苓健脾化痰，山慈菇软坚散结、化痰解毒，蟾酥解毒止痛、开窍醒神，全方标本兼治，共奏健脾除痰、解毒散结之功，对于证属脾虚痰湿之肺癌患者疗效显著。本研究在前期研究基础上[1]，观察益气除痰方对脾虚肺癌小鼠移植瘤组织内质网分子伴侣蛋白GRP94表达的影响，探讨其抗癌的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞和动物

Lewis肺癌细胞株，华西医科大学肿瘤中心。SPF级C57BL/6小鼠54只（6只用于传代），雌雄各半，体质量18～22 g，鼠龄6～8周，重庆医科大学实验动物中心，合格证号SCXK（渝）2012-0001。饲养于重庆医科大学实验动物中心，温度（23±2）℃、湿度（55±10）%，光照12 h，噪音

1.2 药物

益气除痰方，广州中医药大学第一附属医院中药房；番泻叶，重庆医科大学附二院中药房，经重庆医科大学中医药学院林於教授鉴定均为正品。益气除痰方和番泻叶均按照中药常规煎法煎成相当于含原药材2 g/mL的药液，4 ℃冰箱保存。顺铂注射液，齐鲁制药（海南）有限公司，批号2A1A1401002A。

1.3 主要试剂与仪器

胎牛血清、改良型RPMI-1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司），GRP94一抗为兔来源的多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），DAB显色试剂盒、兔SP检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），发光试剂（MILLIPORE 公司），Rever Tra Ace-α-反转录试剂盒、2×SYBR Green（TOYOBO公司）。光学显微镜（日本 Olympus公司），电泳仪、FX9600荧光定量PCR仪、紫外分光光度计（美国Bio-Rad公司），核酸蛋白分析仪（美国Beckman），低温离心机（Sigma公司）。

1.4 造模

1.4.1 脾虚小鼠模型制作 正常C57BL/6小鼠48只，采用苦寒泻下加饥饱失常方式建立脾虚模型，具体方法参照文献[2]：予C57BL/6小鼠100%番泻叶水煎液灌胃，剂量为15 mg/g（即0.15 mL/10 g），隔日禁食，至小鼠出现食欲不振、消瘦、便溏、倦怠乏力等脾虚症状（一般10 d）为造模成功。

1.4.2 Lewis肺癌小鼠模型制作 收集体外培养对数生长期的Lewis肺癌细胞，制成癌细胞悬液，调节细胞数为1×107/mL，将癌细胞悬液接种至6只C57BL/6小鼠背部皮下以供传代，0.2 mL/只。14 d后处死小鼠，剥取肿瘤组织，以无血清培养基制备癌细胞悬液，调节浓度为1×107/mL，接种至脾虚C57BL/6小鼠背部皮下，0.2 mL/只。

1.4.3 分组及给药 根据预实验，接种第6日小鼠皮下肿瘤可明显扪及，中药剂量为4 g/kg时抑瘤作用最佳。故接种第6日，将小鼠随机分为模型组（生理盐水）、化疗组（生理盐水+顺铂注射液1 mg/kg）、联合用药组（4 g/kg益气除痰方药液+顺铂注射液1 mg/kg）和中药低、中、高剂量组（2、4、8 g/kg益气除痰方药液），每组10只。灌胃给药体积为0.2 mL/只，每日1次，连续14 d；顺铂注射液腹腔注射0.2 mL/只，每日1次，连续5 d。

1.5 观察指标

1.5.1 肿瘤体积和质量测定 第21日脱颈处死小鼠，测量荷瘤小鼠肿瘤最长径（a）和最短径（b），计算肿瘤体积（V=0.5ab2，单位：cm3）。取肿瘤称重，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%。

1.5.2 瘤组织形态学观察 取肿瘤组织，肉眼观察其生长情况，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肿瘤组织形态学变化。

1.5.3 免疫组化检测GRP94蛋白表达 取肿瘤组织置于4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、水化、抗原修复等，滴加抗GRP94抗体（1∶100）4 ℃孵育过夜，次日37 ℃复温40 min，PBS冲洗3 min×3，滴加生物素化二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3 min×3，滴加标记亲和素，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3 min×3，DAB显色，苏木素复染，碳酸锂返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片，镜检并摄片。应用Image-ProPlus6.0软件分析图片，选取图片上具有染料色调的区域（Area），测量该区域的积分光密度（IOD）值，选择并测量有效统计区域的面积，计算选择区域内的光密度平均值（IOD/Area）。

1.5.4 Western blot检测GRP94蛋白表达 将肿瘤组织加入组织裂解液，超声匀浆，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白水平。取样品50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转入硝酸纤维素膜（PVDF），封闭，兔抗GRP94抗体以1∶1000比例稀释杂交过夜，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶1000稀释）37 ℃反应1 h，采用化学发光法进行显色，计算机灰度扫描处理。GAPDH作为内参校正上样量。

1.5.5 RT-PCR检测GRP94基因表达 RNA提取后再用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳的方法进行RNA浓度测定。然后进行cDNA制备，加RNA 1 μg，5×RT Buffer 4 μL，RNA Ace 0.5 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，dNTPs 2 μL，Oligo（dT）1 μL，补1‰DEPC水至20 μL。反应条件：42 ℃，10 min；30 ℃，20 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min。依据GenBank上所查mRNA序列，采用Gene tool软件设计引物，内参GAPDH上游5'-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3'，下游5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'；GRP94上游5'-GCGGCGGATTAAGGAAGATG-3'，GRP94下游5'-CTTCTGCGTCTTCTGAGGTGTCT-3'，扩增产物长度152 bp。再加cDNA 2 μL，GRP94上游引物0.5 μL，GRP94下游引物0.5 μL，2×SYBR Green10 μL，H2O 7 μL，共20 μL。反应条件：94 ℃、5 min（94 ℃、30 s57 ℃、30 s72 ℃、30 s）×4072 ℃、10 min。反应结束后，用ABI StepOne Plus PCR System软件分析，计算目的基因Ct值。ΔΔCt=（Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。变化倍率以2-ΔΔCt值表示。

1.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以―x±s表示，组间比较采用方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 益气除痰方对模型小鼠肿瘤体积和质量的影响

与模型组比较，化疗组、联合用药组和中药中、高剂量组均能一定程度降低肿瘤体积和肿瘤质量，其中联合用药组效果最为明显，差异有统计学意义（P

2.2 益气除痰方对模型小鼠移植瘤组织形态的影响

肉眼观察各组小鼠移植瘤呈结节状生长，表面欠光滑，质地较韧，与周围组织粘连，推之不动；外观呈淡粉色鱼肉状，表面有血管分布，部分瘤体中央区有变性、坏死、出血，以联合用药组最为明显。光镜观察模型组肿瘤细胞排列密集，呈片状分布且生长旺盛，细胞结构畸形，核质比例失常，核固缩较少，无坏死或点状坏死，瘤组织内微血管丰富；化疗组核固缩、核碎裂较模型组多，可见片状坏死灶，瘤组织及其周围微血管较为丰富；中药中、高剂量组及联合用药组瘤组织散在分布，核固缩、核碎裂多见，细胞大片坏死，瘤组织微血管较模型组、化疗组减少。

2.3 免疫组化检测益气除痰方对模型小鼠移植瘤组织内质网分子伴侣蛋白GRP94蛋白表达的影响

与模型组比较，化疗组、联合用药组和中药中、高剂量组GRP94光密度平均值明显降低，差异有统计学意义（P

2.4 Western blot检测益气除痰方对模型小鼠移植瘤组织内质网分子伴侣蛋白GRP94蛋白表达的影响

与模型组比较，化疗组、联合用药组和中药中、高剂量组GRP94蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P

D.中药中剂量组；E.中药高剂量组；F.联合用药组

图2 各组小鼠移植瘤组织GRP94蛋白表达免疫印迹电泳图

2.5 RT-qPCR检测益气除痰方对模型小鼠移植瘤组织内质网分子伴侣蛋白GRP94基因表达的影响

与免疫组化、Western blot检测结果一致，化疗组、联合用药组及中药中、高剂量组GRP94基因表达较模型组明显降低（P

3 讨论

细胞内质网的主要功能是完成蛋白质合成、折叠、转运和Ca2+存储，这些功能的完成得益于内质网腔内的许多分子伴侣蛋白。因药物、缺氧、内环境失衡等导致内质网功能紊乱，错误折叠蛋白或非折叠蛋白在内质网腔内聚积，进而对细胞产生毒性，称为内质网应激[3]。该应激不利于细胞的生存，但细胞又具有特异性的针对内质网应激的保护性反应，以确保在不利条件下内质网的蛋白质折叠等功能不被损害，这条特有的保护性反应途径称为未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）。在内质网应激的不利条件下，通过UPR机制确保细胞得以继续生存或凋亡，如果内质网的稳态环境遭到严重破坏，机体可通过内质网应激信号通路诱导细胞凋亡[4-5]。

GRP94又称内质网蛋白99，是内质网中数目最多的葡萄糖调节蛋白，主要贮存于内质网中，参与内质网应激反应，是内质网应激反应中的重要因子。在正常细胞环境下，GRP94可与Ca2+结合具有伴侣蛋白特征，协助新合成多肽的转位、折叠以及寡聚体的组装、分解，抑制错误折叠蛋白的分泌；此外，GRP94还具有抗原呈递作用，可作为肿瘤细胞的伴侣蛋白参与肿瘤细胞的新陈代谢，保护肿瘤细胞免受有害因素的侵害[6]。有关实验显示，GRP94在肺癌、乳腺癌、肝癌、多发性骨髓瘤等肿瘤中均有较高表达，正常细胞演变成肿瘤细胞与GRP94的高表达密切相关，降低GRP94的表达水平可抑制肿瘤细胞生长[7-10]。另有关研究显示，长春新碱、阿霉素、喜树碱等抗肿瘤化疗药物可以在预先诱导GRP94表达的肿瘤细胞系中丢失药效，产生耐药性；降低GRP94的表达可增强化疗药物对肿瘤细胞的敏感性促进肿瘤细胞凋亡[11]。因此，抑制GRP94的表达，有望成为治疗肿瘤的一种新策略。

本实验结果显示，益气除痰方中剂量组、益气除痰方高剂量组、化疗组及联合用药组均能明显抑制小鼠移植瘤生长，促进肿瘤细胞坏死；内质网分子伴侣蛋白GRP94在移植瘤组织中呈现高表达，经益气除痰方治疗后，GRP94蛋白表达明显降低，益气除痰方中剂量组降低最明显，且益气除痰方与顺铂联合使用可明显增强对GRP94的抑制作用。提示益气除痰方可能通过下调GRP94的表达，逆转肿瘤细胞自身保护机制（UPR机制），从而诱导肿瘤细胞凋亡，且益气除痰方与顺铂联合使用可明显增强抑瘤作用。本研究显示，虽然益气除痰方和化疗作用后各组小鼠肿瘤组织GRP94表达均有所降低，但仍呈现较高表达，考虑其可能原因为：在肿瘤引发内质网应激反应的基础上，化疗、脾虚模型的建立亦引发了内质网应激从而启动了UPR机制，致使GRP94过表达，而另一方面益气除痰方、顺铂又具有下调GRP94表达的作用，但两两相互抵消，故而出现以上结果。在今后的实验中考虑建立单纯肺癌模型，以同样的分组及条件重复实验，以检验该推测是否合理。

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（收稿日期：2016-02-25）

（修回日期：2016-03-17；编辑：华强）