替硝唑注射液细菌内毒素检查可行性探讨

摘 要 目的:探讨用细菌内毒素检查法检查替硝唑注射液的热原,提高内毒素的检出率。方法:利用不同厂家生产的鲎试剂与同厂家和不同厂家生产的替硝唑注射液进行干扰试验,全面考察替硝唑注射液对细菌内毒素检查的干扰作用,以确定其最大不干扰浓度及最佳试验浓度。结果:替硝唑注射液最大不干扰浓度为稀释2.5倍,最佳试验浓度为稀释4倍。结论:替硝唑注射液内毒素限值按0.625EU/ml进行细菌内毒素检查安全可靠。

关键词 替硝唑注射液 鲎试剂 细菌内毒素检查法

资料与方法

实验材料:细菌内毒素国家标准品,批号070612,10EU/支,湛江博康海洋生物有限公司。鲎试剂(0.25EU/ml,0.1ml/支),生产厂:①厦门鲎试剂厂,批号071012;②湛江博康海洋生物有限公司,批号070602;③湛江安度斯生物有限公司,批号070210。替硝唑注射液生产厂及批号:安徽丰原药业有限公司,批号080611、080710、080813;湖北广济股份公司生产,批号080510、080613、081012。

方法:细菌内毒素限值的确定:根据药品细菌内毒素限值L=k/m[1],k为细菌内毒素的致热阀,为5EU/(kg•小时),M为热原检查剂量,替硝唑注射液为8ml/(kg•小时);计算结果L=0.625EU/ml。

干扰试验最大有效稀释倍数:L值确定后,根据所有鲎试剂的标示灵敏度(λ)确定样品稀释倍数。最大有效稀释倍数MVD=C/λ,本实验采用0.25EU/ml的鲎试剂,因此替硝唑注射液MVD=2.5。

鲎试剂灵敏度复核[1]试验:所用鲎试剂均进行灵敏度复核。干扰试验[2]。预试验取供试品适量,加细菌内毒素检查用水(BET水)分别稀释成2、4倍稀释液,再取细菌内毒素标准品贮备液适量,用供试品2.5,4倍稀释液分别将细菌内毒素稀释成2λ,0.5λ,0.25λ,0.125λ系列浓度,替硝唑注射液原液测得的Et值大于2.0Es,故判定原液对细菌内毒素检查仍有抑制性干扰,而2.5及4倍稀释液无抑制或增强性干扰,2.5倍稀释液为最大不干扰浓度,4倍稀释液为最佳试验浓度。

干扰试验:用细菌内毒素检查用水,供试品分别将同一支细菌内毒素国家标准品稀释至0.5,0.25,0.125,0.06EU/ml 4个浓度的溶液,采用3个不同厂生产的鲎试剂分别进行干扰试验,具体操作步骤按文献[3]的方法,观察结果并计算λc值,按中国药典规定,若0.5λ≤λc≤2λ(λc=0.25EU/ml),则证明供试品对BET无干扰。

对照试验:按照文献方法对安徽丰原药业有限公司和湖北广济股份公司生产的6批替硝唑注射液进行热原检查。

结 果

将上述6批替硝唑注射液按文献方法[3]分别进行细菌内毒素检查。结果见表1。

讨 论

替硝唑注射液用于各种厌氧菌感染,如败血症、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支气管感染、鼻窦炎、皮肤蜂窝组织炎、口腔感染及术后伤口感染;也用于结肠直肠手术、妇产科手术及口腔手术等的术前预防用药。现已广泛应用于临床。

内毒素是多种革兰阴性菌的细胞壁成分,由菌体裂解后释出的毒素,又称之为“热原”。单位Eu/ml。其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物,其毒性成分主要为类脂质A。内毒素位于细胞壁的最外层、覆盖于细胞壁的黏肽上。各种细菌的内毒素的毒性作用较弱,大致相同,可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等。内毒素耐热而稳定,抗原性弱。可刺激机体产生抗体,但无中和作用,形成抗毒素,经甲醛处理不能成为类毒素。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来,所以叫做内毒素。内毒素不是蛋白质,因此非常耐热。在100℃的高温下加热1小时也不会被破坏,只有在160℃的温度下加热2～4小时,或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟才能破坏它的生物活性。与外毒素不同之处在于:内毒素不能被稀甲醛溶液脱去毒性成为类毒素;把内毒素注射到机体内虽可产生一定量的特异免疫产物(称为抗体),但这种抗体抵消内毒素毒性的作用微弱。不同革兰阴性细菌的脂质A结构基本相似。因此,凡是由革兰阴性菌引起的感染,虽菌种不一,其内毒素导致的毒性效应大致类同。

本品的作用机制尚未完全阐明,厌氧菌的硝基还原酶在敏感菌株的能量代谢中起重要作用。本品的硝基被还原成一种细胞毒,从而作用于细菌的DNA代谢过程,促使细菌死亡。耐药菌往往缺乏硝基还原酶而对本品耐药。

采用3个不同厂家生产的鲎试剂分别进行替硝唑注射液细菌内毒素干扰试验,结果基本一致,其中湛江安度斯生产的鲎试剂干扰试验结果与灵敏度复核结果完全相同,测得λc值均在不干扰范围之内,故替硝唑注射液的细菌内毒素检查采用任一厂生产的鲎试剂均可。本实验证实,替硝唑注射液对BET无干扰作用。所以选择λ=0.25 Eu/ml的鲎试剂样品稀释2.5倍进行BET即可。

安徽丰原药业有限公司和湖北广济股份公司生产的替硝唑注射液分别进行细菌内毒素检查,其结果与热原检查结果均一致。因此替硝唑注射液采用细菌内毒素检查法是可行的。

参考文献

1 中国药典.2000年版.2000:204.

2 田光彩.清开灵注射液细菌内毒素检查可行性探讨.中国药师,2005,8(5):430-431.