榄香烯抑制尾加压素-II诱导的人晶状体上皮细胞增殖的信号转导机制

摘 要:目的:探讨榄香烯(elemene,Ele)抑制尾加压素II (Urotensin II,U-II)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)增殖及信号转导机制。方法:将U-II诱导体外培养的HLEC发生增殖,并用不同浓度的Ele与其共同孵育后,用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测HLEC的活性;用流式细胞术(flow cytometer,FCM)检测HLEC增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达;用荧光分光光度法检测HLEC内游离钙离子浓度[Ca2+]i;用放射免疫分析法检测HLEC内环化腺苷酸(cyclicadenosine monophosphate,cAMP)和环化鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)浓度。 结果: U-II组HLEC活性、PCNA蛋白表达和cGMP浓度均高于对照组(P

关键词:尾加压素II; 榄香烯; 晶状体上皮细胞;增殖;信号转导;后发性白内障

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0015-04

The Inhibitory Eeffect of Elemene on Proliferation Induced by Urotensin-II in

Human Lens Epithelial Cell and the Machenism of Signal Transduction

QI Mingxin1,HUANG Xiurong2,HU Jun2,YANG Liying2

(1.Department of Ophthalmology,The Second Affiliated Hospital,Fuzhou 350003,Fujian,China;

2.Research Center of Pathophysiology,Fujian College of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350003,Fujian,China)

Abstract:Objective:To study the inhibitory effect of elemene(Ele)on proliferation induced by urotensin-IIin human lens epithelial cell(HLEC)and the mechanism of signal transduction.Methods:The proliferations of cultured HLEC were induced by urotensin-II(U-II),which were incubated with different concentrations of Ele. The HLEC activities were detected via methyl thiazolyl tetrazolium(MTT). The proliferating cell nuclear antigen(PCNA)of HLEC were detected via flow cytometer(FCM)heconcentration of intracellular free calcium([Ca2+]i)of HLEC were determined with Fura-2/AM by spectrofluoremeter.The intracellular contents of cyclic adenosine monophosphate(cAMP)and cyclic guanosine monophosphate(cGMP)of HLEC were assayed by radioimmunoassay.Results:The activity,expression of PCNA and the cGMP concentration of HLEC in U-II group were higher than that in control group,there were decreased in Ele group significantly(P

Key words:Urotensin II;elemene; lens epithelial cell;proliferation;signal transduction;after cataract

榄香烯(elemene,Ele)是从姜科植物莪术、郁金中提取的一种倍半萜烯类衍生物。研究表明Ele能抑制多种细胞增殖[1]。有报道Ele可抑制肝星状细胞增殖并促进其凋亡[2]、Ele可抑制血管内皮生长因子诱导的牛视网膜色素上皮细胞增殖[3]。本课题组曾报道Ele可抑制表皮生长因子诱导的牛晶状体上皮细胞(lens epithelial cell,LEC)增殖[4]。

尾加压素II (Urotensin II,U-II)是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质[5]。其促进细胞增殖的作用已见报道[6]。本课题组的研究曾发现U-II可诱导LEC增殖,该结果将另文报道。

后发性白内障 (after cataract)是白内障术后的主要并发症。因术后残留的LEC发生增殖、移行,使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。本文拟探讨Ele 对U-II诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cell,HLEC)增殖的影响及其细胞信号转导机制,为寻求防治后发性白内障的有效药物提供科学依据。

1材料

1.1细胞将冻存于液氮内的永生性人晶状体上皮细胞系B-3(humen lens epithelial cell B-3,HLEB-3)进行复苏,置37 ℃、5%的CO2培养箱中培养,取对数生长期的细胞制成悬液并调整细胞密度为1×105 个/mL,用传代培养的细胞进行以下实验。

1.2 试剂榄香烯(elemene,Ele)为大连金港制药有限公司产品,人尾加压素II(human urotensin II,hU-II)为美国Phoenix公司产品,DMEM培养基(dulbecco,s modified eagle,s medium)和胰蛋白酶(trypsin)为美国GIBCO公司产品,四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、乙二醇-双四乙酸(Ethylene glycol-bis tetraacetic acid,EGTA)和Triton X-100为美国Amresco公司产品,乙二胺四乙酸(ethylenediaminotetraacteic acid,EDTA)为美国Augus公司产品,Fura-2/AM为美国Sigma公司产品,新生牛血清(newborn calf serum,NCS)为奥地利PAA公司产品,小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原单克隆抗体和FITC标记山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司,I125 cAMP和I125 cGMP放免试剂盒来自上海中医药大学同位素室。

1.3仪器流式细胞仪(美国Becton Dickison)、全自动酶标仪(美国BIO-RAD680)、荧光分光光度计(日本岛津RF-5000)、二氧化碳培养箱(美国FORMA 2111)、倒置相差显微镜(日本Olympus IMT-413)、微量移液器(法国GILSON)、真空泵(美国EF006)、γ-放射免疫计数仪(西安FJ-2008PS)、超净工作台(江苏SW-CJ-IF)。

2实验方法

2.1四甲基偶氮唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测HLEC活性取对数生长期的HLEC,调整细胞密度至1×105个/mL,在37℃,5% CO2培养箱中培养24h,使细胞同步化。实验共分为5组,每组6个样本。对照组在HLEC中加入DMEM培养液;U-II组在对照组的基础上加入终浓度为10-8mol/L的U-II。高、中、低浓度Ele组分别在U-II组的基础上加入终浓度为160 mg/L 、80 mg/L 和40 mg/L 的Ele。孵育24h后,吸去培养液,分别加入终浓度为0.5mg/mL的MTT 100μL,继续培养4h,吸去MTT,加入DMSO溶液,振荡混匀,于全自动酶标仪上用490nm比色测定吸光度A值,再按公式计算出增殖抑制率(inhibition rate,IR)。

2.2流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测HLEC增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达

所采用的HLEC和实验分组同MTT检测法。按实验分组加样后孵育24h,常规消化,将细胞转移至流式细胞检测专用试管中,离心、PBL漂洗、75%冷甲醇4℃固定细胞12 h后,再离心、PBS漂洗去固定液。加封闭液,混匀后置室温30 min。加稀释的PCNA单克隆抗体,置4℃ 30min(阴性对照以PBS代替一抗,其他步骤同前,以便试机、调零)。再离心、PBS漂洗、弃上清。加FITC标记的羊抗鼠IgG二抗、4℃避光放置30 min。离心、PBS漂洗、弃上清。最后以PBS 1 mL悬浮细胞,用FCM检测HLEC核内PCNA蛋白阳性表达率。在cellquest软件下进行分析。

2.3荧光分光光度法检测HLEC内Ca2+浓度([Ca2+]i)

所采用的HLEC同上。实验分为对照组、U-II组和Ele组(终浓度为80 mg/L Ele),按实验分组加样后孵育24h,常规消化、收集细胞。将待测细胞制成悬液,细胞活性在95%以上,加入终浓度为2.5μmol/L的Fura-2/AM于37 ℃,5% CO2培养箱中避光负载35 min(每隔10min震荡1次)。最后将细胞悬液调整细胞数为2×106个/mL。以荧光分光光度计检测,发射波长为510 nm,激发波长为340 nm与380 nm,两波长下最大荧光由加入终浓度为0.5% Triton测得,最小荧光由加入终浓度为8 mmol/L(pH>8.5)的EGTA获得。经计算机软件辅助用计算公式可算出细胞内[Ca2+]i=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)×R。其中,Kd为Fura-2与Ca2+反应的解离常数,常温下其值为224 nmol/L,F为实验观察到的荧光比值,Fmax是Fura-2全部为Ca2+饱和时的荧光比值,Fmin由通过加入过量的钙螯合剂将钙螯合来获得。R为380 nm处无Ca2+和Ca2+饱和时荧光强度的比值。

2.4放射免疫法检测HLEC内cAMP、cGMP浓度所采用的HLEC同上。实验分为对照组、U-II组和Ele组(终浓度为80mg/L Ele),按实验分组加样后孵育24h,消化收集细胞,待测细胞以1 mL的醋酸缓冲液制成悬液。反复冻融后,分别按照I125 cAMP放免试剂盒和I125 cGMP放免试剂盒的说明进行操作,用γ-放射免疫计数仪测得HLEC内的cAMP和cGMP浓度。

2.5统计学处理实验结果用SPSS 13.0统计软件分析。所有结果用均数±标准差(±s)来表示。各组与对照组间数据比较采用t检验,各组间数据比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)。

3结 果

3.1MTT法检测Ele对U-II诱导的HLEC活性增高的抑制作用MTT法检测结果显示(见表1),U-II组吸光值与对照组比较显著增高(P

3.2Ele对HLEC内PCNA表达的影响FCM检测结果显示(见表2):U-II组PCNA表达率与对照组比较显著升高(P

3.3Ele对HLEC内Ca2+浓度([Ca2+]i)的影响表3显示:U-II组与对照组比较[Ca2+]i显著升高(P

3.4Ele对HLEC内cAMP和cGMP浓度的影响表4显示:U-II组cAMP浓度与对照组比较显著降低(P

4讨论

4.1Ele能下调HLEC内PCNA蛋白表达 抑制U-II诱导的HLEC增殖近年来有学者的研究发现,U-II对多种类型的细胞有促增殖作用。有研究[7]发现U-II具有促丝裂效应,能促进实验大鼠多种细胞,如心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)发生增殖。还有研究发现肾上腺髓质素、降钙素基因相关肽等均能浓度依赖性地抑制U-Ⅱ诱导的VSMC增殖[6,8]。本课题的研究也曾发现U-II能显著诱导牛LEC发生增殖,提出这可能是白内障手术后残留的LEC增殖并移行至后囊下发生后发性白内障的发病机制(另文报道)。

已有报道Ele能抑制多种细胞增殖。Ele是从姜科植物莪术、郁金中提取的一种倍半萜烯类衍生物[1]。Ele可能通过抑制细胞周期蛋白磷酸化来调控G1/S关卡,从而抑制肝星状细胞增殖并促进其凋亡[2];也有研究发现Ele可抑制血管内皮生长因子诱导的牛视网膜色素上皮细胞的DNA合成,从而抑制细胞增殖,提示Ele可能在治疗血管增殖性视网膜病变中具有潜在的临床价值[3]。本课题组的前期研究表明Ele可抑制重组人表皮生长因子诱导的牛LEC增殖[4]。但有关Ele抑制U-II诱导的HLEC增殖的作用,国内外文献尚未见报道。

PCNA是一种与细胞增殖有关的、参与DNA合成的、稳定的细胞周期相关性白,能较可靠的反映细胞群体的增殖活性。近年来,有关于Ele对细胞内PCNA表达影响的报道,发现β-榄香烯可下调PCNA表达、降低DNA合成及多倍体比率,从而抑制大鼠胃黏膜增殖活性[28]。但Ele下调LEC内PCNA表达从而抑制细胞增殖的研究尚未见报道。

本研究采用MTT法检测HLEC活性、FCM检测HLEC内PCNA蛋白表达。结果发现U-II组HLEC活性增高;PCNA蛋白表达率较对照组显著升高,高、中、低不同浓度的Ele组的PCNA蛋白表达率均较U-II组显著降低,Ele能显著抑制U-II促进的HLEC增殖,且呈浓度依赖关系。本实验结果说明:U-II可能通过上调HLEC内PCNA蛋白表达而促进细胞增殖、参与后发性白内障的发生。高、中、低不同浓度的Ele能下调HLEC内PCNA蛋白表达,使参与DNA合成的PCNA被抑制,从而使DNA合成受阻,影响细胞增殖周期,这可能是Ele抑制U-II促进的HLEC增殖的一种机制。该结果为开发防治后发性白内障的有效药物提供了科学的实验依据。

4.2HLEC[Ca2+]i信号转导是Ele对U-II诱导增殖的抑制作用的信号转导机制之一Ca2+信号转导途径处于多种细胞信息传递途径的中心位置。Ca2+作为重要的细胞内第二信使,在细胞增殖等方面发挥重要的作用。Ca2+在细胞内发挥生理作用需要与蛋白结合,其中钙调蛋白(Calmodulin,CaM)最为重要[9]。当细胞受到外来刺激后,可引起细胞内[Ca2+]i的变化,Ca2+与CaM结合,形成Ca2+-CaM复合物,激活一系列蛋白激酶,促使蛋白质磷酸化,从而参与对细胞增殖的调节。

有研究表明U-II促细胞增殖作用与其刺激胞内[Ca2+]i升高及Ca2+介导的信号转导通路密切相关。钙通道阻断剂尼卡地平能部分抑制U-II的促细胞增殖效应,表明U-II促丝裂作用部分是由胞外Ca2+内流所介导。目前认为U-II与GPR14结合,通过电压依赖性和电压非依赖性钙通道促进Ca2+内流,引起胞内Ca2+增加而发挥生物学效应[10-11]。本课题组的前期研究发现U-Ⅱ能显著地促进牛LEC增殖,且PKC\\MAPK\\CaM\\钙通道阻断剂可抑制U-II对牛LEC的增殖作用,该结果将另文报道。

本研究发现U-II组HLEC [Ca2+]i较对照组显著升高(P

4.3HLEC内cAMP和cGMP信号转导是Ele对U-II诱导增殖的抑制作用的另一信号转导机制cAMP和cGMP信号系统是细胞内重要的信息传递通路,在调节细胞的生长和分裂中起着至关重要的作用。有研究认为cAMP激活PKA(Protein kinase A,PKA),进而抑制p21 ras下游的p2l ras分裂原,激活蛋白激酶信号传递途径,从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖[12]。肾上腺髓质素和降钙素基因相关肽可能通过增加cAMP、抑制丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)的激活,从而抑制U-II的促VSMC增殖效应[6,8]。cGMP可激活cGMP依赖蛋白激酶即蛋白激酶G(Protein kinase G,PKG),实现其对细胞的多种生物学效应。当cGMP浓度升高时,可促进细胞内核酸和组蛋白合成,加速细胞分裂,提高细胞增殖水平。cGMP在细胞内含量很少,通常只有cAMP的l/10-1/50,但发挥着重要的调节细胞增殖的作用。可见cAMP与cGMP的作用互相拮抗,cAMP/cGMP的比值被认为可作为细胞生长代谢和增殖的指标[13]。

经查阅国内外文献,有关U-II与HLEC内cAMP、cGMP生物学效应的关系尚未见报道。也未见Ele对HLEC内cAMP、cGMP影响的报道。本研究结果发现,U-II组cAMP浓度较对照组显著降低,而cGMP浓度较对照组显著升高。表明U-II可能通过降低HLEC内cAMP浓度,减弱cAMP的抗增殖作用;通过升高cGMP浓度,促进核酸和组蛋白的合成,最终诱导HLEC增殖。本研究进一步发现Ele使HLEC内cAMP浓度较U-II组显著升高,cGMP浓度较U-II组显著降低。表明Ele可能在细胞周期的某一过程通过使胞内cAMP浓度增高,进而激活PKA,使靶蛋白上的丝氨酸和苏氨酸磷酸化,从而发挥抑制U-II所诱导的HLEC增殖的作用。与此同时,Ele可能通过降低细胞内cGMP浓度,干预cGMP-PKG信号转导途径,影响细胞周期进程,抑制DNA合成,从而拮抗U-II对HLEC的增殖效应。这说明cAMP-PKA和cGMP-PKG信号转导途径很可能参与调控Ele抑制U-II诱导HLEC增殖的作用。

参考文献

[1] 康可人,黄秀榕,祁明信.天然药物诱导细胞凋亡的研究进展[J].中国病理生理杂志,2002,18(6):725-729.

[2] 杨玲,钱伟,侯晓华.β-榄香烯对肝星状细胞周期及凋亡的影响[J].中华消化杂志,2006,28(8):555-556.

[3] 接传红,郭彤,张惠蓉.血管内皮生长因子对牛视网膜色素上皮细胞DNA合成的影响和榄香烯抗增殖作用的研究[J].中国中医眼科杂志,2001,11(2):75-77.

[4] 黄秀榕,祁明信,胡艳红,等.榄香烯抑制表皮生长因子诱导的晶状体上皮细胞增殖的信号转导机制[J].中国临床药理学与治疗学,2007,12(1):43-46.

[5] Matsushita M,Shichiri M,Fukai N,et al. Urotensin II is an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line[J]. Endocrinology,2003,144:1125-1831.

[6] 齐永芬,夏春芳,陈亚红,等.肾上腺髓质素对尾加压素II刺激的血管平滑肌细胞增殖的影响[J].中国病理生理杂志,2002,18(3):230-232.

[7] 张勇刚,陈亚红,马春艳,等.尾加压素的促丝裂作用[J].中国动脉硬化杂志,2001,9(1):14-16.

[8] 袁杰,李菊香,李国华,等.降钙素基因相关肽对尾加压素II诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响[J].贵阳医学院学报,2002,21(3):129-132.

[9] 符民桂,唐朝枢. 细胞Ca2+信号对基因转录的调节[J].国外医学•生理、病理科学与临床分册,1999,19(5):348-352.

[10] 张正浩,张孙曦,李菊香,等.钙信号在尾加压素-II促血管平滑肌增殖中的作用[J].北京大学学报(医学版),2002,34(3):261-265.

[11] Ames RS,Sarau HM,Chambers JK,et al. Human urotensin-II is a potent vasoconstrictor and agonist for the orphan receptor GPR14[J]. Nature,1999,401(6750):282-286.

[12] Peter LH,Ingridet V,Kees J,et al. cAMP abrogates the p21ras-mitogen-activated protein kinase pathway in fibroblasts[J]. J Biol Chem, 1994,269:3534-3538.

[13] 司维柯,,姚婕.苦参碱对HepG2细胞代谢水平和基因水平的影响[J].第三军医大学学报,2002,24(11):1346-1349.