穿心莲内酯对白念珠菌生物膜分散的影响

[摘要]随着真菌感染日渐增多，白念珠菌的防治成为当前抗真菌感染的重点。该研究拟探讨中药单体穿心莲内酯（AG）对白念珠菌生物膜分散的影响。实验以微孔板结合医用导管片构建白念珠菌生物膜模型，分别通过XTT减低法和平板法发现1 000，500，250 mg・L-1AG 能不同程度的影响白念珠菌生物膜分散细胞的活性；以扫描电镜观察导管片残余生物膜形态结构，发现1 000，500，250 mg・L-1AG能剂量依赖性的诱导白念珠菌生物膜的分散，且分散出的细胞以酵母相为主；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测发现AG使HSP90表达上调，使UME6和PES1表达下调。该研究表明AG能一定程度的诱导白念珠菌生物膜分散。

[关键词]穿心莲内酯；白念珠菌；生物膜；分散

近年来，白念珠菌作为条件致病菌所引起的真菌感染病例日益增多，其致病性与形成生物膜密切相关，而后者是导致其高度耐药性和反复感染的重要原因，生物膜成熟周期包括黏附、形成微菌落、释放胞外多聚物、形成成熟稳定的三维结构及后期生物膜细胞的分散（dispersion）等阶段，而从生物膜上分散下来的细胞易造成菌细胞定植至新的部位，造成感染的播散[1]。

穿心莲内酯（andrographolide，AG）是从穿心莲的全草或叶中分离的二萜类化合物，有较显著的抗细菌、真菌和肿瘤效果。本课题组在前期研究中发现，中药单体AG对白念珠菌生物膜形成具有一定的抑制作用，能明显抑制体外白念珠菌的黏附以及介导白念珠菌凋亡[2-4]。为较系统地研究AG对白念珠菌生物膜整个发育周期的影响，故在前期研究基础上考察其对白念珠菌生物膜分散干预的效果。

1 材料

1.1 菌株 白念珠菌Candida albicans SC5314，由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。

1.2 药物与试剂 穿心莲内酯（中国食品药品检定研究院，批号110797-201108）。25%戊二醛溶液（国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（博美生物科技有限公司）；XTT（加拿大BBI公司）；维生素K3（美国Alexis公司）；PBS缓冲液（本室配制）；Total RNA提取试剂（日本ToyoBo公司）；PCR试剂（日本ToyoBo公司）。RPMI-1640 液体培养基（pH 7.0±0.1），滤过灭菌，4 ℃保存备用。

1.3 仪器 12孔培养板（美国Corning公司）；SpectraMax M2e 多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；血细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；ABI7000荧光定量PCR仪（美国生物应用系统公司）。

2 方法

2.1 白念珠菌液和导管片的制备[5] 从4 ℃保存的沙氏培养基上挑取白念珠菌单个菌落，接种于RPMI-1640培养基，于37 ℃培养箱孵育，使白念珠菌处于生长对数期后再次活化，血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养基稀释浓度至2×106 CFU・mL-1备用。将医用聚氨酯导管（直径2.4 mm）裁割长为1 cm，75%乙醇过夜除菌，再以胎牛血清浸泡37 ℃过夜，用PBS缓冲液轻洗2次待用。

2.2 白念珠菌生物膜分散实验 将白念珠菌浓度用RPMI-1640培养基调整为2×106 CFU・mL-1，导管片放入12孔板，每孔加入2 mL菌液，37 ℃孵育24 h。无菌条件下弃去菌液，取出黏附有生物膜的导管片，以灭菌PBS缓冲液清洗3遍，除去导管片表面未黏附细胞，置于新的12孔板，加入含AG培养基（终浓度为1 000，500，250 mg・L-1）2 mL，氟康唑对照组（FLC，256 mg・L-1），同时设空白对照组，分别培养2，8，12，24 h。

2.3 XTT法检测来自生物膜的分散细胞活性 以0.5 g・L-1林格液配制XTT并用0.22 μm孔径过滤器除菌，临用前加入维生素K3（menadione，浓度10 mmol・L-1）。分别于AG作用2，8，12，24 h后，取出导管，充分混匀菌悬液，取100 μL 加入新96孔板，加XTT-维生素K3溶液60 μL，37 ℃避光培养2 h。酶标仪492 nm检测吸光度A。实验重复3次，每浓度设置3复孔，取平均值。

2.4 导管片残余生物膜CFU计数 AG作用生物膜2，8，12，24 h后，从12孔板中取出导管片，用PBS缓冲液轻洗导管片2次后，振荡仪涡旋30 s，超声仪4万Hz超声5 min，使生物膜从导管片上脱离下来。将菌悬液按1∶10系列稀释后，取适量均匀涂于沙氏琼脂平皿，37 ℃培养48 h后计数CFU。实验重复3次，取平均值。

2.5 扫描电镜检查残余生物膜形态结构 将待检测的导管片标本，以PBS缓冲液轻洗2次，预冷2.5%戊二醛溶液避光固定3 h，PBS缓冲液轻洗2次，乙醇梯度脱水（30%，10 min；70%，10 min；100%，10 min），过夜干燥后镀金，扫描电镜观察并拍照。

2.6 AG对白念珠菌生物膜分散相关基因表达的测定[6] 基因表达实验检测AG对白念珠菌生物膜分散相关基因HSP90，UME6和PES1的影响。在AG干预24 h后，3 000 r・min-1离心5 min收集菌体后进行总RNA提取。提取过程参照MagExtractor-RNA提取试剂盒说明书进行。据NCBI基因库查得基因序列，并用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物（表1）。

逆转录成cDNA：检测A260/A280，调节RNA浓度，使菌体模板量一致。依据逆转录试剂盒说明书，将提取的总RNA反转录成cDNA。

实时荧光定量PCR反应：按SYBR Green Realtime PCR Master Mix试剂盒配制反应液如下：2×SYBR Green Master Mix 12.5 μL，上游引物（10 μmol・L-1）1 μL，下游引物1 μL，cDNA 0.5 μL，蒸馏水，共25 μL。反应条件设置为：预变性 95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 15 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 45 s，共40 循环。采用ABI7000荧光定量PCR仪进行扩增反应。实验平行重复3次。

实时荧光定量PCR分析：以ACT1为内参，测定每个样品目的基因的Ct值。结果以软件Graphpad Prism 5.0进行分析，利用2-ΔΔCt法计算各基因表达水平，用倍数变化表达。

2.7 统计学处理 实验数据采用SPSS 17.0作统计学处理，计量资料以±s表示，组间差异比较采用ANOVA检验，P

3 结果

3.1 AG对白念珠菌生物膜的分散细胞活性的影响 通过酶标仪492 nm检测A，计算不同时间段AG诱导白念珠菌生物膜分散的百分率。结果显示250 mg・L-1AG作用生物膜后，与对照组对照，于2，8，12，24 h诱导生物膜分散率达21%，各组间无显著性差异；500 mg・L-1 AG诱导白念珠菌生物膜分散率随时间递增，24 h后反而降低至34%；1 000 mg・L-1AG干预生物膜后，2，8 h诱导生物膜分散率均为41%，12 h后诱导49%生物膜分散，24 h后诱导41%生物膜分散；各组各时间点诱导生物膜分散率均低于FLC（256 mg・L-1）组（图1）。

3.2 AG对导管片上残余生物膜CFU的影响 将AG作用后的导管片上生物膜振荡下来，计数CFU，可见AG组对体外白念珠生物膜的抑制效果较弱，其中250 mg・L-1AG作用生物膜后，2，8 h组CFU与对照组无显著性差异，12，24 h组CFU明显少于对照组；500 mg・L-1AG作用生物膜后，2 h后CFU与对照组无差异，8，12 h组CFU递减，24 h组CFU反而高于12 h；1 000 mg・L-1AG 作用生物膜后，2，8，12，24 h组CFU递减，明显少于对照组；各浓度和时间点CFU均多于FLC（256 mg・L-1）组（图2）。

3.3 AG对导管片上残余生物膜形态结构的影响 通过扫描电镜观察AG诱导白念珠菌生物膜分散24 h后形态结构，发现对照组生物膜完整，菌丝相和酵母相交织，形成立体的生物膜结构；250，500，1 000 mg・L-1AG能剂量依赖性地诱导白念珠菌生物膜分散；其中250 mg・L-1AG组残余生物膜只含有较多酵母相细胞，未见菌丝贯穿其内；500 mg・L-1AG 组白念珠菌酵母相细胞数有所减少；1 000 mg・L-1AG组只有稀疏分布的酵母相细胞（图3）。

4 讨论

白念珠菌生物膜是白念珠菌细胞产生胞外多聚基质（ECM）将大量菌丝与酵母相细胞包被于其中而形成的结构性聚集体[7]。在生物膜成熟周期末，生物膜的分散一方面有利于其在营养限制之前重新定植其他部位形成新的生物膜，引起白念珠菌的感染播散；另一方面菌细胞从生物膜中分散出来成为浮游菌，将有利于抗生素等杀菌剂对其清除。白念珠菌从生物膜到浮游菌的转变是个复杂的过程。换言之，如果将白念珠菌从生物膜状态恢复成浮游状态，也就是生物膜的分散，将有利于恢复杀菌剂的敏感性。Uppuluri P等[8]研究发现，两性霉素B在流动模型中能促进白念珠菌生物膜的分散，降低细胞活性。

本课题组在前期实验中发现，中药单体AG能有效抑制白念珠菌生物膜的形成，在白念珠菌生长早期能抑制其形态转变，为了考察AG是否能够诱导白念珠菌生物膜分散，实验通过体外构建白念珠菌成熟生物膜，以AG干预后，不同时间段检测生物膜分散细胞的活性。结果发现，250 mg・L-1AG干预生物膜后，不同时间段分散细胞活性均在20%左右，无显著性差异；500 mg・L-1AG作用生物膜，发现随着时间延长，分散细胞活性升高，提示AG可诱导生物膜的分散；1 000 mg・L-1AG则可以明显诱导生物膜分散，但是在24 h后，分散细胞活性降低，推测AG在较高浓度下作用较长时间后抑制了部分细胞的活性。对导管片残余生物膜CFU计数结果发现，250 mg・L-1AG作用生物膜，12，24 h计数CFU与对照组有显著性差异；500 mg・L-1AG干预生物膜后，计数导管CFU发现，随着干预时间的逐渐延长，以1 000 mg・L-1AG干预的效果最明显。导管片上CFU的减少提示AG对生物膜有一定的清除作用或诱导其分散作用。同时，SEM观察导管片上残余生物膜形态结构发现，不同浓度AG干预后残余生物膜均不完整，且酵母相居多，其中1 000 mg・L-1AG组只见酵母相，表明AG充分抑制了菌丝相，且具有诱导白念珠菌生物膜分散作用，分散出来的细胞以酵母相为主。

通过前面实验发现AG可以诱导白念珠菌生物膜分散，因此从基因层面进一步来探讨其作用机制，检测与白念珠菌生物膜分散相关的3个主要基因表达情况。其中，2个为促分散基因――HSP90和PES1，其主要功能是将菌丝相转化为酵母相，以及促进酵母相细胞从生物膜中分散出去；一个为抗分散基因――UME6，其主要功能是促进菌丝特异性转录、菌丝延长以及生物膜中菌丝相的增加和酵母相的减少，妨碍生物膜分散[9-13]。可见，上述2类基因分别通过调节生物膜中菌细胞的双相性――菌丝相和酵母相而发挥对生物膜促分散/抗分散的作用。

针对上述3个白念珠菌生物膜分散相关基因进行qRT-PCR实验，结果显示AG干预后，促分散的HSP90基因上调以及抗分散的UME6基因下调，2种基因的表达结果均有利于酵母相细胞从生物膜分散；但另一促分散基因PES1下调。就所检测的3个生物膜分散相关基因的表达而言，生物膜的促分散效应超过抗分散效应；但FLC对3个基因表达的影响均有利于白念珠菌生物膜的分散。

白念珠菌生物膜分散除了遗传因素外，营养、pH等环境因素也有所影响。因此，关于AG诱导白念珠菌生物膜分散的具体机制还有待进一步研究。

AG诱导白念珠菌生物膜分散提示可以将处于生物膜状态的耐药性强的菌细胞转变成游离状态而利于抗真菌药物的抑制或杀伤，故可考虑将AG与敏感的抗真菌药物联合治疗，其抗真菌抗生物膜的效果应会更好。

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Effect of andrographolide on Candida albicans biofilm dispersion

SHI Gao-xiang1，2， YAN Yuan-yuan1，2， SHAO Jing1，2， LU Ke-qiao1，2， ZHANG Meng-xiang1，2，

WANG Tian-ming1，2， WANG Chang-zhong1，2*

（1. School of Integrated Chinese and Western Medicine， Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China；

2. Institute of Integrated Chinese and Western Medicine， Anhui Academy of Chinese Medicine， Hefei 230038， China）

[Abstract] Along with the increase in fungal infections， Candida albicans prevention and control become the focus of anti-fungal infection at present. This study aims to discuss the effect monomer andrographolide （AG） on C. albicans biofilm dispersion. In the experiment， micro-well plates and medical catheter pieces were used to establish the C. albicans biofilm model. It was discovered by XTT assay and flat band method that 1 000， 500， 250 mg・L-1 AG could impact the activity of C. albicans biofilm dispersion cells. The morphological structures of residual biofilms on catheter pieces were observed with scanning electron microscopy， which showed that 1 000， 500， 250 mg・L-1 AG could induce C. albicans biofilm dispersion in a dose-dependent manner， and the dispersed cells were dominated by the yeast phase. According to the real-time fluorescence quantification PCR （qRT-PCR） test， AG could up-regulate HSP90 expression and down-regulate UME6 and PES1 expressions. This study demonstrates that AG could induce C. albicans biofilm dispersion to some extent.

[Key words]andrographolide； Canidia albicans； biofilm； dispersion

doi：10.4268/cjcmm20141726