高住低训抑制大鼠骨骼肌mTOR蛋白表达

摘 要：目的：探讨运动和低氧影响骨骼肌生长的分子调控机制。方法：SD大鼠分为6组：1) 28 d组，包括对照组、常氧运动组、低氧暴露组、高住低训组；2) 复氧7 d组，包括低氧暴露复氧7 d组、高住低训复氧7 d组，每组6只。常氧运动组进行4周的跑台运动。低氧暴露组白天与对照组在常氧下生活，晚上在氧浓度13.6%低氧舱内低氧暴露12 h；复氧7 d组进行低氧暴露后复氧7 d。高住低训组每天运动后1 h进行低氧暴露。实验后取腓肠肌称重，采用western blot测定mTOR蛋白表达。结果：1) 28 d常氧运动后骨骼肌mTOR蛋白表达明显上降（p

关键词：低氧；高住低训；翻译调控；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）

中图分类号：G804.2

文献标识码：A

文章编号：1007-3612(2008)08-1073-03

On the Living-High-Training-Low Restraining mTOR Protein Expression of Skeletal Muscle in Rats

HE Dao-yuan1, ZENG Fan-xing2, WANG Wei-ming1

(1.College of Physical Education, Three Gorges University,Yichang 443002,Hubei China; 2.Beijing Sports University,Beijing 100084,China)

Abstract:Objective: to research the effect of exercise and hypoxia on

skeletal muscle growth and its mechanism of molecular regulation. Methods: SD rats were divided into 6 groups:(1) 28-days groups, included control group, normoxic exercise group, hypoxic exposure group, living high training low (HiLo) group.(2) 7-days reoxygen groups, included 7 days of reoxygen groups after hypoxic exposure,7 days of reoxygen groups after HiLo. Normoxic exercise group were carried out treadmill running for 4 weeks. Hypoxic exposure group were treated with 13.6% concentrations of oxygen for 12 h/day under normobaric conditions in hypoxic chamber. 7 days of reoxygen groups were treated with 7 days of reoxygen after hypoxic exposure. HiLo group were exposed to hypoxia following 1 hour after exercise. After gastrocnemius muscle weighing, mTOR expression in gastrocnemius muscle were tested with the method of western blot. Results: 1) After exercisefor 28 days, mTOR protein expression in muscle increased significantly（p

Key words: hypoxia; living-high-training-low(HiLo); translation regulation; mammalian target of rapamycin (mTOR）

低氧运动抑制肌肉生长会导致骨骼肌丢失及力量下降等问题，但具体机制不清楚。肌肉生长的调控与基因表达的调控有关，基因表达的调控主要包括转录的调控和翻译的调控。翻译是连接基因组和蛋白组的桥梁，翻译的调控是基因表达的调控的重要环节。

大量的细胞培养实验表明低氧抑制蛋白合成，与mTOR信号有关。而低氧运动影响骨骼肌蛋白合成，但其机制不清楚。为了阐明低氧运动对蛋白合成的调控机制，本研究测试了高住低训大鼠骨骼肌mTOR蛋白表达变化，我们假设运动后mTOR蛋白表达增加，低氧及运动后mTOR表达下降。

1 材料和方法

1.1 动物及分组 健康雄性、SPF级2月龄的SD大鼠(许可证号：SCXK(京)2002-0001 动物编号：0068277)，体重180～200 g，由北京大学医学部实验动物中心提供。昼夜节律人工控制光照(光照时间为07:00-19:00)，环境温度(23±2)℃，动物自由取食及饮水，饲养一周后用于实验。实验动物随机分组，共分为6组：对照组（C）、常氧运动组（E）、低氧暴露组（H）、高住低训组（HL）；低氧暴露组、高住低训组又分为28 d组和复氧7 d组，每组6只。

1.2 运动与低氧暴露模型 运动组先进行适应性训练6 d，坡度为5°，速度分别为10 m/min、15 m/min、20 m/min，进行强度递增的适应运动，每日1次，每次30 min；然后进行正式跑台运动：上坡跑，跑台坡度5°，速度20 m/min，60 min/次, 6次／周。常氧运动组大鼠在适应性运动后进行正式跑台运动4周，高住低训组运动4周（28 d组）或5周（复氧7 d组）。对照组均不运动，其生活条件与运动组相同。

采用间歇低氧暴露方式进行低氧暴露。使用人工低氧舱（美国Hypoxic Systems tent-1型低氧帐篷）模拟氧浓度13.6%（相当于海拔高度3 500 m）低氧环境。打开低氧仪，让低氧帐篷内的氧浓度降到13.6%，并稳定1 h后，将大鼠放入，进行低氧暴露。低氧暴露组白天生活在常氧环境，晚上进行低氧暴露12 h（20:00-8:00）。高住低训组于每天运动后1 h同时于同一低氧环境进行相同持续时间的低氧暴露。28 d低氧暴露组低氧暴露28 d，复氧7 d组在低氧暴露28 d后出低氧舱后剩余7 d不再进行低氧暴露。对照组、常氧运动组为常氧环境，不进行低氧暴露。

1.3 组织匀浆及总蛋白含量测定 大鼠低氧暴露后即刻取材。对大鼠进行25%乌拉坦腹腔麻醉，腹主动脉取血后，取右侧后肢完整腓肠肌，去筋膜和脂肪等，称重。用于匀浆的肌肉样品，被切成重约100 mg大小，加10倍体积（1 mL）的预冷的匀浆缓冲液于玻璃匀浆器中冰上匀浆，静置10 min，转移至1.5 mL EP中。12 000 g 4℃ 离心10 min。取上清，用于总蛋白含量测定及western blot测定。

总蛋白含量采用BCA测试方法，按试剂盒（PIERCE）说明进行。

1.4 免疫印迹 取1份（100 μg）肌肉匀浆上清液，加入等体积的SDS上样缓冲液，100℃煮沸5 min，使蛋白变性。将变性后的蛋白全部上样，最右边的一泳道加蛋白质标准。在5%的浓缩胶以20 mA恒流，10%的分离胶（或7.5%的分离胶）以40 mA恒流的条件下电泳约2 h。电泳结束后取出凝胶，采用湿转的方法将凝胶上的蛋白转移到NC膜上。转膜结束后把NC膜放入含5% BSA（w/v）的封闭液培养皿中，于室温轻摇1 h进行封闭。取出膜，装入保鲜膜袋中，将用封闭液适当稀释过的一抗（mTOR为1:1 000购自cell signal）加入到NC膜，4℃振荡孵育过夜封闭。将一抗孵育过的NC膜用TBST洗3次，15 min/次。取出NC膜，装入保鲜膜袋中，将适当稀释过的辣根酶标记山羊抗兔IgG（1:2 000，中杉金桥ZB-2 301)加入到NC膜，室温振荡孵育1 h。将二抗孵育过的NC膜用TBST洗3次，15 min/次。用ECL发光试剂（Santa Cruz No. sc-2048）发光，底片曝光，显影、定影，扫描仪扫描，测定目的条带光密度值。结果采用待测样品目的条带光密度与对照光密度比较相对值。

1.5 统计处理 实验结果用均数士标准差表示。全部统计学分析均采用SPSS 11.5统计软件进行，组间比较采用方差分析，以P

2 结 果

2.1 低氧暴露和运动对大鼠骨骼肌质量的影响 常氧运动、低氧暴露及高住低训对大鼠腓肠肌重量影响见表1。常氧运动组、低氧暴露组及高住低训组28 d后肌肉质量显著低于常氧安静组，其中高住低训组最低，低氧暴露组其次，常氧运动组最小（p

2.2 低氧暴露和运动对大鼠骨骼肌质量的影响 实验各组中都检测到了289kD处蛋白条带，表明mTOR存在着表达（图1）。

持续28 d的变化。28 d后常氧运动组mTOR蛋白表达显著上升，增加49.1%（p

注：结果为平均数±标准差，n=6，a表示与对照相比有显著差异，p

复氧7 d的变化。与28 d低氧暴露组比，低氧暴露再复氧7 d组mTOR表达显著升高，为410%（p

注：结果为平均数±标准差，n=6，a表示与对照相比有显著差异，p

3 分析讨论

3.1 高住低训后骨骼肌质量下降 本研究发现，28 d高住低训导致肌肉质量显著下降，复氧7 d后肌肉质量显著回升，表明高住低训对骨骼肌生长友明显的抑制。这可能与低氧和运动两种因素都有关。有报道大鼠6周的低氧暴露和低氧训练时肌肉重量下降［1］，本实验也观察到安静低氧暴露导致肌肉含量显著下降。运动对肌肉质量影响与运动方式有关［2］，一般抗阻力运动导致肌肉的肥大，而耐力运动对肌肉的肥大没有明显的作用。我们的研究表明运动28 d耐力运动后肌肉含量也有一定程度的下降，但幅度比高住低训小。

肌肉质量的下降表明低氧运动影响蛋白代谢。因为肌肉质量的下降包括液体成分和蛋白的丢失，因而蛋白的状况会受影响。

3.2 高住低训后骨骼肌mTOR蛋白表达下降 mTOR即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其活性可被一种链霉菌的衍生物雷帕霉素（rapamycin）所阻断。许多学者认为mTOR是目前除了AMPK之外的又一个对能量敏感的感受器，能监测细胞内AMP浓度的变化。在细胞的生长、分化、增殖、迁移和存活上扮演了重要的角色。mTOR是一种大分子蛋白质，分子量为289 kDa，由2 459个氨基酸分子组成。mTOR蛋白氨基酸组成非常保守，人、大鼠的mTOR之间有95%的氨基酸一致［3］。

mTOR可以感受细胞能量状况（AMP/ATP）、环境中营养状况以及生长因子刺激信号传递途中的PI3K信号。激活后的mTOR再将信号传递给下游三种主要靶蛋白p70S6K、4E-BP1、eIF4G，这些靶蛋白是蛋白质合成的重要调控因子，能激活蛋白质的合成。因此mTOR对于蛋白质翻译起始复合物的形成、核糖体的生成以及多肽链的延伸等蛋白质翻译过程正常进行起着至关重要的作用。

一些研究表明，运动及电刺激等引起肌肉负荷增加会刺激骨骼肌mTOR磷酸化及总蛋白表达［4］。Parkington［5］报道对坐骨神经进行高频电刺激后即刻趾肌中mTOR磷酸化增加3.4倍（p

低氧暴露抑制机体蛋白质合成［10］。低氧抑制蛋白质合成可能因为低氧暴露降低ATP浓度，导致蛋白质合成抑制；低氧训练对蛋白质合成代谢的影响的机制不太清楚，可能存在多种作用途径。吸入体内的氧浓度高低和低氧暴露时间的长短可能直接的调节骨骼肌蛋白质的合成。O2浓度对蛋白质合成非常重要，蛋白质的生物合成特别是起始阶段是一个非常耗能的过程，缺氧会导致肌细胞利用氧的减少，能量缺乏，使骨骼肌蛋白质的合成受阻。运动后的恢复期对蛋白合成代谢的影响至关重要，因为运动期蛋白分解加强合成抑制，而运动后恢复其蛋白合成加强，分解减弱。低氧运动后的的低氧环境可能导致恢复不充分影响蛋白合成。有研究表明低氧抑制蛋白翻译过程，而mTOR参与其中［11,12］。但有关研究主要为细胞研究，即采用细胞培养的方法对生长中细胞mTOR信号的影响，而有关活体研究的海很少报道。我们研究对象为大鼠，结果显示大鼠低氧暴露28 d后骨骼肌mTOR表达下降86.6%，复氧mTOR表达显著升高，为410%（p

目前还没有任何有关低氧复合运动对mTOR信号影响的报道［13，14］。我们首次研究了低氧复合运动对mTOR表达的影响。结果表明28 d高住低训组mTOR蛋白表达明显下降，为92.1%（p

4 结 论

耐力运动28 d后大鼠骨骼肌mTOR蛋白表达明显增加。28 d高住低训导致肌肉质量显著下降，复氧7天后肌肉质量显著回升，骨骼肌生长被明显抑制。28 d高住低训后骨骼肌mTOR蛋白表达明显下降，复氧7 d后又显著回升。提示高住低训调控骨骼肌生长的分子机制可能在于通过运动、低氧影响mTOR蛋白表达进而调控骨骼肌蛋白翻译过程。

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