SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

【关键词】 肝肿瘤

Stable inhibition of hTERT gene by sirna in hepatocarcinoma cells

【Abstract】 AIM: To elucidate the timeefficiency relation of stable inhibition of hepatocarcinoma cell proliferation by RNA interference in vitro. METHODS: The stable screeninginhibition technique of RNAi was adopted to suppress the expression of hTERT stably. After small hairpin RNA (shRNA) targeting hTERT gene was designed, recombinant vector pGenesilshRNAhTERT was constructed and transfected into hepatocarcinoma SMMC7721 cells, which were stably selected by G418 to establish hepatocarcinoma cell lines stablely expressing pGenesilshRNAhTERT. Realtime RTPCR, MTT and PCRTRAP were utilized to detect the alterations of hTERT mRNA expressions, telomerase activity and cell proliferation. RESULTS: The effectiveness of RNAi existed continually and stably in hepatocarcinoma SMMC7721 cells expressing stably pGenesilshRNAhTERT. In the cell lines expressing stably pGenesilshRNAhTERT, hTERT mRNA was obviously suppressed, and the telomerase activities were significantly decreased. Hepatocarcinoma SMMC7721 cell proliferation significantly inhibited in pGenesilshRNAhTERT group compared to that in negative control group. CONCLUSION: RNAi may continually and stably suppress hTERT mRNA expression and carcinoma cell proliferation, which is a potential new approach for antitumor gene therapy.

【Keywords】 RNA interference; liver neoplasms; telomerase

【摘要】 目的： 利用RNA干扰稳定筛选抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达，探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时效关系. 方法： 设计靶向htert基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesilshRNAhTERT并导入肝癌SMMC7721细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNAhTERT的细胞株. 采用realtime RTPCR、MTT和PCRTRAP法同时检测pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组和未处理SMMC7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化. 结果： 在稳定表达pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，hTERT mRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制. 结论： RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖，是有潜力的基因治疗肿瘤新方法.

【关键词】 RNA干扰；肝肿瘤；端粒，末端转移酶

0引言

端粒酶的异常表达与恶性肿瘤的发生发展和预后密切相关［1］， hTERT基因在肝癌中的表达阳性率为89.5%［2］. 研究表明hTERT的高表达能通过多分化刺激来抑制细胞凋亡，导致细胞永生化［3］. 我们依据RNA干扰（RNA interference, RNAi）原理，使用短发夹样RNA（small hairpin RNA, shRNA）设计的RNAiDNA载体方法［4］，以hTERT基因为靶点，构建稳定表达小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA) 的肝癌SMMC7721细胞株，从体外研究siRNA稳定、特异诱导hTERT基因转录后沉默，逆转癌细胞恶性表型的能力，探讨RNAi基因治疗恶性肿瘤的时效性.

1材料和方法

1.1材料

肝癌SMMC7721细胞株购自上海细胞生物研究所. 质粒pGenesil1购自武汉晶赛生物工程技术有限公司. 限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购自Roche公司,总RNA提取试剂、转染试剂LipofectamineTM2000等分别购自Takara和Invitrogen公司；端粒酶TRAPHyb Kit购自华美生物工程公司. Taqman探针和引物由Takara公司合成，hTERT及内参PO的探针和引物序列参照文献［4］. siRNAhTERT转录模板由上海博亚公司合成.

1.2方法

shRNA发夹结构序列长度为69 bp，两端分别为BamHⅠ, HindⅢ酶切位点，中间为9 bp茎环序列分隔的反向重复靶序列，并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子. 质粒构建采用BamHⅠ, HindⅢ双酶切空质粒pGenesil1，将shRNAhTERT转录模板5′AAGTTCCTGCACTGGCTGATG3′（AF 015950 nucleotides 16821702）和阴性对照转录模板5′AAGCTTCATAAGGCGCATAGC3′ （与人基因无同源性）分别设计成发夹结构，定向克隆至该载体上，经筛选、酶切鉴定后，进行测序确定，命名为pGenesilshRNAhTERT，阴性对照命名为pGenesilshRNAPK. 质粒转染与G418筛选采用LipofectamineTM2000脂质体转染法. 操作按说明书进行，质粒∶脂质体=1∶3. 2 wk后可见长出筛选克隆. 筛选克隆的鉴定：荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达变化. 分别收集第一代稳定表达pGenesilshRNAhTERT和pGenesilshRNA PK的肝癌SMMC7721细胞106个，进行RTPCR扩增鉴定.

1.2.1实时RTPCR检测hTERT mRNA表达实时PCR反应体系25 μL，内含5×realtime PCR Buffer 5 μL, 300 μmol/L dNTP, 5 mmol/L MgCl2, hTERT上下游引物［4］各200 nmol/L，相应荧光探针120 nmol/L, Taq酶1.25 U, CDNA 2 μL，水补齐到25 μL. 95℃ 3 min后，按下述条件进行循环： 95℃ 15 s, 65℃ 25 s, 40周期，每个样本设3个平行反应. 换取引物和探针［5］，按前述同样条件进行内参照PO（编码人酸性核糖体磷酸蛋白）的实时RTPCR检测. 结果数据采用RotorGene RealTime Analysis Software进行定量分析. hTERT mRNA含量N hTERT（标化）以hTERT/PO的相对比值来确定，其中hTERT为端粒酶逆转录酶基因的拷贝数，PO为内参照基因拷贝数.

1.2.2端粒酶活性检测采用PCRTRAP法检测端粒酶活性，培养细胞106个经4000 r/min离心10 min，沉淀加入裂解液，取上清2 μL做TRAP反应模板. 在PCR反应管中各加入反应混合物45 μL，混匀，离心数秒，置25 ℃水浴30 min. PCR仪扩增，各孔加入杂交反应液反应，洗板，加显色剂A，B各1滴，37℃避光显色10 min，加终止液，在酶标仪上（450 nm/595 nm）测得A值，判断端粒酶活性.

1.2.3MTT实验收集对数生长期未处理的以及稳定筛选的肝癌SMMC7721，接种96孔板，细胞终密度为2×104/孔，每个样本设3个平行孔，每孔总体系200 μL，试剂空白以无血清DMEM培养液补足. 37℃, CO2孵箱中培养24 h，在每孔中加入四甲基偶氮唑蓝（MTT，0.5 g/L），继续培养4 h，弃上清，加入二甲基亚砜200 μL，振荡5 min，酶标仪（570 nm）读取A值. 细胞增殖抑制率=（1-实验组平均A值/对照组平均A值）×100%.

统计学方法： 数据用x±s表示，采用SPSS10.0软件进行单因素方差分析. P＜0.05即认为有统计学差异.

2结果

重组质粒pGenesilshRNAhTERT和pGenesilshRNAPK经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，同时做pGenesil1空载体双酶切对照. 20 g/L琼脂糖电泳，pGenesil1空载体经双酶切后呈2条带，分别为4.54 kb的载体片段和364 bp的小片段；而重组质粒则为4.54 kb的载体片段和425 bp的目的片段. 测序结果均正确. 质粒转染后在荧光显微镜下观察，可见转染后第1日镜下表现为少量明亮的绿色荧光，主要位于细胞核内（Fig 1A）；而稳定筛选建株后的SMMC7721细胞镜下表现为大量明亮的绿色荧光，同样位于细胞核内（Fig 1B）. 根据稳定筛选前后荧光蛋白表达变化可初步说明建株成功. 对已转染pGenesilshRNAhTERT和pGenesilshRNAPK的肝癌SMMC7721细胞，通过PCR扩增，均可得到210 bp的扩增产物 （Fig 2），说明转染质粒DNA已整合到SMMC7721细胞染色质上，稳定筛选建株成功.

2.1实时RTPCR检测hTERT mRNA表达阴性对照pGenesilshRNAPK组与未处理SMMC7721细胞组间无差别； pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组中，检测第2代（稳定建株后7 d）、第8代（稳定建株后30 d）和第15代（稳定建株后60 d），发现与未处理SMMC7721细胞组相比，hTERT mRNA表达均明显降低，其差异具有统计学意义(P<0.01, Tab 1).表1实时荧光定量PCR检测各组hTERT mRNA表达（略）

2.2端粒酶活性检测端粒酶活性以A值高低表示，对稳定表达pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721细胞第2代、第8代和第15代分别设3个复孔进行检测，其吸光度均值分别为0.58, 0.56, 0.62, pGenesilshRNAPK组与未处理SMMC7721细胞组吸光度均值分别为1.51和1.48，空白对照均值为0.06. 可见稳定表达pGenesilshRNAhTERT的SMMC7721细胞组端粒酶活性明显降低.

2.3细胞增殖抑制实验pGenesilshRNAhTERT稳定抑制组中，第2代、第8代和第15代细胞增殖抑制率分别为49%, 53%和50%，高于pGenesilshRNAPK组相应代别的细胞增殖抑制率（5%, 9%和7%）.

3讨论

端粒酶全酶由端粒酶RNA（hTR）、端粒酶相关蛋白(TP1)和端粒酶催化亚基（hTERT）三部分组成. 其中hTERT是端粒酶全酶活性的限速因素，与肿瘤的关系更为密切. 资料显示hTERT基因在肝癌的表达阳性率约为89.5%［2］. 我们利用RNAiDNA载体和瞬时转染技术，成功抑制了肝癌细胞中hTERT基因的表达，并在一定程度上逆转了肿瘤的恶性表型，但同时发现存在RNAi效力持续时间短的问题［6］.

Thijn R等［7］使用pSUPER质粒长期、稳定地抑制了相关基因的表达. 本研究中，我们所使用的pGenesil1质粒带有EGFP基因、U6启动子、G418抗性基因和卡那霉素抗性基因等，可进行稳定筛选. 而EGFP基因、U6启动子由于启动方向相反而互不干扰，既可使shRNA进行正常的转录，在细胞内诱导RNAi，同时对于质粒的转染以及稳定筛选都可通过绿色荧光蛋白表达而直观地监测.

我们通过实时定量RTPCR对稳定表达pGenesilshRNAhTERT的肝癌SMMC7721细胞mRNA进行了长时间（60 d）的连续检测，发现hTERT mRNA持续、稳定地被抑制，其抑制程度并不随时间而减弱. 说明合理选择靶向hTERT的siRNA，通过shRNA表达载体的方法可对hTERT基因进行长期的稳定抑制. hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素，其表达的下调势必会引起端粒酶活性的降低以及端粒缩短，破坏染色体稳定性而抑制细胞生长并促进细胞凋亡，逆转肿瘤细胞恶性表型［8］，我们通过检测端粒酶活性和对肿瘤细胞增殖的抑制也证实了这点.

本研究利用DNA载体RNAi技术对hTERT进行稳定抑制，构建了稳定表达pGenesilshRNAhTERT的肝癌SMMC7721细胞株，发现pGenesilshRNAhTERT可持续、稳定地下调hTERT mRNA表达，抑制端粒酶活性及肿瘤细胞增殖，逆转肝癌细胞的恶性表型，为肝癌基因治疗的临床应用开辟了新的思路.

【参考文献】

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Du H, Wang J, Zhen WG, et al. Effects of antisense nucleic acids against hTERT mRNA on viability of human ovarian cancer HO8910 cells ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24(15): 1362-1365.

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［6］ 张鹏辉，涂植光，杨明清，等. RNAi干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究［J］. 癌症, 2004; 23(6): 619-625.

Zhang PH, TU ZG, Yang MQ, et al. Experimental research of targeting hTERT gene inhibited in hepatocellular carcinoma therapy by RNA interference ［J］. Chin J Cancer, 2004;23(6): 619-625.

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［8］ Kyo S, Inoue M. How to inhibit telomerase activity for cancer therapy ［J］. Curr Med Chem Anti Canc Agents, 2002; 2 (5): 613-626.