聚乳酸高分子材料的生物安全性评价

【摘要】对可降解聚乳酸塑料进行生物学安全性评价，为食品包装材料的应用提供依据。参照原中华人民共和国卫生部《化学品毒性鉴定技术规范》中生物学评价的方法和要求，对聚乳酸塑料急性毒性、亚急性毒性试验，致突变毒性（Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验及染色体畸变试验），遗传毒性（染色体畸变、小鼠畸形试验、胎鼠致畸）等系列生物安全性进行研究。结果表明该材料的生物学检测结果均为阴性，提示该材料具有良好的生物学安全性。

【关键词】生物降解塑料 聚乳酸高分子材料 生物安全评价

引言

随着环境问题的日益严重和绿色化学的兴起，生物降解材料的研究越来越引人注目。聚乳酸（polylactic acid，PLA）是一种热塑性脂肪族聚酯化学物，是由乳酸为原料直接缩聚，或者为提高材料性能在其中加入一定比例的交联剂偶联聚合后得到的高分子化合物。聚乳酸产品可以通过生物途径快速降解，如一些微生物或蛋白酶可以促进其降解，因此聚乳酸被认为是具有广泛应用前景的绿色塑料。近年来，成型加工工艺的改进可以有效地提高聚乳酸薄膜的结晶速率和结晶度，提高了聚乳酸薄膜的阻湿阻氧能力。

有研究表明，聚乳酸材料很好地生物相容性，可作为医疗用途。聚乳酸材料应用于食品包装的应用受到广泛的关注。食品包装材料的生物安全是食品安全的重要组成部分，生物安全性是生物可降解材料应用于食品包装用途的首要条件，聚乳酸高分子材料应用与食品包装用途的生物安全性还有待进一步的评价。本研究依据《化学品毒性鉴定技术规范》中生物学评价的要求对聚乳酸塑料进行了系统的生物安全性评价，包括急性毒性、亚急性毒性试验，致突变毒性，遗传毒性等，为聚乳酸塑料的食品包装用途提供生物安全性依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

聚乳酸：分子量≥5万道尔顿

1.2 实验方法

1.2.1 受试物处理

受试物处理：将聚乳酸粉末预粉碎后用10%碳酸二甲酯溶解后，加入同等体积的无水乙醇沉淀。过滤取滤渣分别过120目和200目筛待用。

1.2.2 致突变性毒性

（1）Ames试验。选用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，采用平板掺入法进行试验。采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆，经生物活性鉴定合格后作为体外代谢活化系统。根据毒性测定结果，试验用样品共设8μg/皿、40μg/皿、200μg/皿、1000μg/皿、5000μg/皿5个剂量组，同时设阳性对照、溶剂对照（加入10%的吐温80替代样品溶液）、未处理对照。在顶层琼脂中加入0.1 ml试验菌株增菌液，0.1ml试验用样品溶液和0.5mlS-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上，每个剂量3个平皿。在37±1℃培养48h，计数每皿回变菌落数。试验用样品组回变茵落数超过自发回变的2倍以上；进行活化（加S-9）和非活化（不加S 9）试验，并具有剂量一反应关系时即判定为阳性。试验在相同条件下重复做两次。

（2）小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。试验用样品设2.0g/kg、4.0g/kg体重3个剂量组。同时设溶剂对照（10%吐温80水溶液）和阳性对照（环磷酰胺40mg/kg体重，腹腔注射）。采用间隔24h次经口灌胃法给予聚乳酸。末次给试验用样品6h后，颈椎脱臼处死动物。取股骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Glemsa染色。双盲法阅片。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），计算微核发生率。每只动物观察200个嗜多染红细胞，计数成熟红细胞（NCE），计算PCE/NCE比值。

（3）小鼠骨髓染色体畸变试验。试验用样品设1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg体重3个剂量组。同时设溶剂对照（10%吐温80水溶液）和阳性对照（环磷酰胺40mg/kg体重，腹腔注射）。采用间隔24h经口灌胃法给予聚乳酸，连续5天。末次给试验用样品6h后用颈椎脱臼法处死动物，于处死采集样品前4h腹腔注射4 0mg/kg秋水仙素。取出股骨，剔除肌肉等组织，制备骨髓细胞悬液，用姬姆萨染液染色，计数畸变细胞：对每只动物选择100个分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。所得各组的染色体畸变率用x 2检验进行统计学处理，以评价试验组和对照组之间是否有显著差异。

1.2.3 小鼠急性毒性试验（最大耐受剂量法）

选用18g-22g健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，进行试验。聚乳酸最大使用浓度0.5g/mL，灌胃容量为20mL/kg体重，即以10.0g/kg体重的剂量，2次灌胃，每次间隔6小时，连续观察14天，记录中毒状况和死亡情况，确定最大耐受剂量（MTD）。

1.2.4 亚慢毒性试验（90天喂养试验）

采用离乳大鼠（试验开始时体重为70g-85g，差异不超过平均体重的±20%）80只，雌雄各半。随机分为0.25g/kg、0.50g/kg、1.00g/kg体重3个剂量组和基础饲料对照组。实验用样品的掺入量分别为0.312%、0.625%、1.25%，动物单笼饲养，每天观察并记录动物的一般表现，行为、中毒表现和死亡情况。每周称一次体重和两次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率；在试验中期和末期分别测定血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类、血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、葡萄糖、血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇、甘油三酯等；称量肝、肾、脾、的脏器绝对重量和计算脏体比。对各剂量组动物大体检查未发现明显病变时，进行高剂量组和对照组的肝、肾、胃、肠、脾、、卵巢的病理组织学检查，并进行统计学处理。

1.2.5 遗传毒性实验

（1）小鼠染色体畸变试验。选用健康常年雄性体重25g-30g小鼠，每组5只。试验用样品设1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg体重3个剂量组。同时设溶剂对照（10%吐温80水溶液）和阳性对照（环磷酰胺40mg/kg体重，腹腔注射）。灌胃给予受试药物，每天一次，连续5天。受试药物后的第15天脱臼处死、制片。于处死采集样品前4h腹腔注射4.0mg/kg秋水仙素。取组织，制备悬浮液，用姬姆萨染液染色，计数畸变细胞：对每只动物选择100个分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。所得各组的染色体畸变率用x2检验进行统计学处理，以评价试验组和对照组之间是否有显著差异。

（2）小鼠畸形试验。用体重25g-30g的性成熟雄性小鼠25只，随机分为5组。以1.5mg/kg体重剂量的丝裂霉素C（经口给予）为阳性对照，10%吐温80水溶液为溶剂对照，试验用样品设1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg体重3个剂量组。每日灌胃一次，连续5天，末次灌胃后30天处死动物，取附睾制片，伊红染色，高倍镜下检查小鼠的形态，每组计数5只动物，每只动物计数1 000个结构完整的，计算畸变发生率（以百分率计），并进行统计处理。

（3）致畸试验。25g-30g的孕鼠25只，随机分为5组。以1.5mg/kg体重剂量的丝裂霉素C（经口给予）为阳性对照，10%P：b～80水溶液为溶剂对照，试验用样品设1.0g/kg、2.0gAg、4.0g/kg体重3个剂量组。孕鼠处死和一般检查：小鼠于妊娠第20d处死。剖腹检查卵巢内黄体数，取出子宫，称重；检查活胎、早期吸收和死胎数；活胎鼠检查；胎鼠骨检查；胎鼠内脏检查。

1.3 数据处理

采用SPSS软件进行数据处理。对计量资料采用单因素方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值

2 实验结果

2.1 急性毒性

参照食品安全学评价程序有关实验的要求，对聚乳酸进行了急性毒性试验。将聚乳酸粉碎，过120目筛。选用军事医学科学院实验动物中心繁殖的BALB/C二月龄雄性小鼠10只，经口给予10g/kg体重的聚乳酸水悬液，间隔6小时重复给予一次。连续观察14天，未发现小鼠出现毒负作用症状；非发现小鼠出现死亡情况。实验表明经口给予聚乳酸LD50>10g/kg，属于实际无毒。表明聚乳酸不会对生物产生急性毒性。

2.2 亚慢毒性试验（90天喂养试验）

对聚乳酸进行大鼠90天喂养试验。试验过程中未见动物有明显异常表现。试验期间大鼠活动自如、毛发光亮、饮水、进食、大小便正常。聚乳酸对各剂量组大鼠的体重、进食量及食物利用率与对照组比较，雌、雄性均无显著性差异（P>0.05）。临床检查、血液学检查、血液生化学检查、脏器称量等结果表明各检验项目的实验组与对照组比较，差异不显著（P>0.05）。大体检查各剂量组大鼠共80只，雄、雌各半。剖检后肉眼观察，心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、（卵巢）、脑等主要脏器的颜色、形状、大小等均未见明显异常。病理组织学检查结果表明对照组和高剂量实验组雌、雄性大鼠的肝、肾、胃、肠、脾、、卵巢均未见明显损伤性病理变化和与聚乳酸有关的病理组织学改变。

2.3 致突变性毒性

2.3.1 AMES实验

用聚乳酸进行Ames试验。各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照组回变菌落数2倍以上，亦无剂量―反应关系，对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，在加与不加肝微粒体酶活化系统时，结果均为阴性，而且试验结果可重复，说明聚乳酸无致突变活性。

2.3.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

对聚乳酸进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。各剂量组两种性别小鼠骨髓多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/RBC）在1.16-1.23之间，未见试验用样品对两种性别小鼠的骨髓细胞增殖有抑制作用。各剂量组雌、雄小鼠骨髓多染红细胞微核发生率与样品溶剂对照组比较均无显著性差异（P>0.05）；而环磷酰胺组与样品溶剂对照组比较，有显著性差异（P

2.3.3 小鼠骨髓染色体畸变试验

经口给予小鼠2.0g/kg体重、4.0g/kg体重聚乳酸5天后，与溶剂对照组比较，小鼠骨髓染色体畸变细胞率在两个剂量组与溶剂对照组组间比较，均无显著性差异（P>0.05）。表明聚乳酸在2.0g/kq体重、4.0g/kq体重剂量范围内无致骨髓细胞突变作用。聚乳酸对小鼠体重增长无不良影响。

2.4 遗传毒性

2.4.1 小鼠染色体畸变试验

选用中国医学科学院实验动物研究所[许可证号：SCXK-京2004-001]繁殖的25g-30g昆明种健康清洁级雄性小鼠进行小鼠染色体畸变试验。经口给予小鼠2.0g/kg体重、4.0g/kg体重聚乳酸5天后，观察结果显示在本实验剂量范围内聚乳酸不引起小鼠初级精母细胞染色体畸变数增加，说明聚乳酸在2.0g/kg体重、4.0g/kg体重剂量范围内无致生殖细胞突变作用。聚乳酸对小鼠体重增长无不良影响。

2.4.2 小鼠畸形试验

对聚乳酸进行小鼠畸形试验。各剂量组小鼠畸形发生率与样品溶剂对照组比铰无显著性差异（P>0.05）；而丝裂霉素C组小鼠畸形发生率与样品溶剂组比较，有显著性差异（P

2.4.3胎鼠致畸试验

选用军事医学科学院实验动物中心[许可证号：SCXK（军）2007-004]繁殖的SD大鼠进行致畸试验。1.0g/kg体重剂量组的聚乳酸对孕鼠体重、子宫总重，胎鼠体重、身长、胎盘重及着床率、活胎率、外观畸胎率、骨骼畸胎率、内脏畸胎率无明显影响。即在1.0g/kg体重剂量未发现聚乳酸有致畸作用。

结语

实验结果表明，聚乳酸高分子化合物经大鼠口最大耐受剂量均大于10.0g/kg体重，且未发现亚急性毒性，属实际无毒物质。AMES实验未发现聚乳酸具有致突变性毒性，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核、染色体畸变作用为阴性，表明受试物无致突变活性。遗传毒性实验结果为阴性，表明聚乳酸没有遗传毒性作用。

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