生物可降解二氧化碳基塑料的生物安全性评价

【摘要】对可降解二氧化碳基塑料进行全面的生物学评价，为食品包装材料的制造和应用提供依据。参照原中华人民共和国卫生部《化学品毒性鉴定技术规范》中生物学评价的要求，对二氧化碳基塑料急性毒性、亚急性毒性试验，致突变毒性（Ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验及染色体畸变试验），遗传毒性（染色体畸变、小鼠畸形试验、胎鼠致畸）等系列生物相容性试验研究。结果表明该材料的生物学检测结果均在阴性，提示该材料具有良好的生物学安全性。

【关键词】生物降解塑料 二氧化碳基材料 生物安全评价

引言

当前世界塑料工业技术的迅速发展，塑料用途已渗透到工业、农业以及人民生活的各个领域，已经成为国民经济发展的支柱材料。但是塑料的大量使用后随之也带来了大量的固体废弃物。目前城市固体废弃物中塑料的质量分数已达1 0%以上，体积分数则在30%左右，而其中大部分是一次性塑料包装及日用品废弃物，它们对环境的污染、对生态平衡的破坏已引起了社会极大的关注。二氧化碳基塑料是以二氧化碳和环氧化物为主要原料共聚合而成的新型绿色高分子材料。该材料既可高效利用二氧化碳，变废为宝，又具有良好的氧气阻隔性、透明性，并可实现完全生物降解，有望广泛应用于食品包装领域。但是，二氧化碳基材料的生物安全性还有待进一步的评价。本研究依据《化学品毒性鉴定技术规范》中生物学评价的要求对二氧化碳基塑料进行了系统的生物安全性评价，包括急性毒性、亚急性毒性试验，致突变毒性，遗传毒性等，为二氧化碳基塑料的食品包装用途提供生物安全性依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

二氧化碳基塑料（聚对二氧环己酮，PPD0树脂）：分子量≥10万道尔顿

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1.2 实验方法

1.2.1 受试物处理

将聚二氧化碳基塑料低温粉碎后分别过120目和200目筛待用。

1.2.2 小鼠急性毒性试验（最大耐受剂量法）

选用18g-22g健康昆明种小鼠20只，雌雄各半，进行试验。聚二氧化碳基塑料最大使用用浓度0.25g/mL，灌胃容量为20mL/kgBW，即以10 0g/kgBW的剂量，2次灌胃，每次间隔6小时，连续观察14天，记录中毒状况和死亡情况，确定最大耐受剂量（MTD）。

1.2.3 亚慢毒性试验（90天喂养试验）

采用离乳大鼠（试验开始时体重为70g-85g，差异不超过平均体重的±20%）80只，雌雄各半。随机分为0_25g/kqbw、0.50g/kgbw、1.00g/kgbw3个剂量组和基础饲料对照组。实验用样品的掺入量分别为0.312%、0.625%、1.25%，动物单笼饲养，每天观察并记录动物的一般表现，行为、中毒表现和死亡情况。每周称一次体重和两次食物摄入量，计算每周及总的食物利用率；在试验中期和末期分别测定血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及分类、血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐、葡萄糖、血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇、甘油三酯等：称量肝、肾、脾、的脏器绝对重量和计算脏体比。对各剂量组动物大体检查未发现明显病变时，进行高剂量组和对照组的肝、肾、胃、肠、脾、、卵巢的病理组织学检查，并进行统计学处理。

1.2.4致突变性毒性

（1）Ames试验。选用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，采用平板掺入法进行试验。采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆，经生物活性鉴定合格后作为体外代谢活化系统。根据毒性测定结果，试验用样品共设8 ug/皿、40μg/皿、200μg/皿、1000μg/皿、5000μg/皿5个剂量组，同时设阳性对照、溶剂对照（加入10%的吐温80替代样品溶液）、未处理对照。在顶层琼脂中加入0.1ml试验菌株增菌液，0.1ml试验用样品溶液和0.5mlS-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上，每个剂量3个平皿。在37±1℃培养48h，计数每皿回变菌落数。试验用样品组回变菌落数超过自发回变的2倍以上；进行活化（加S-9）和非活化（不加S-9）试验，并具有剂量一反应关系时即判定为阳性。试验在相同条件下重复做两次。

（2）小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。选用体重25g-30g小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。试验用样品设1.0g/kgBW、2.0g/kgBW、4.0g/kgBW3个剂量组。同时设溶剂对照（10%吐温80水溶液）和阳性对照（环磷酰胺40mg/kgBW，腹腔注射）。采用间隔24h两次经口灌胃法给予聚二氧化碳基塑料，连续5d。末次给试验用样品6h后，颈椎脱臼处死动物。取股骨骨髓用小牛血清稀释涂片，甲醇固定，Glemsa染色。双盲法阅片。在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCE），计算微核发生率。每只动物观察200个嗜多染红细胞，计数成熟红细胞（NCE），计算PCE/NCE比值。

1.2.5 遗传毒性实验

（1）小鼠染色体畸变试验。选用健康常年雄性体重25g-30g小鼠，每组5只。试验用样品设1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg体重3个剂量组。同时设溶剂对照（10%吐温80水溶液）和阳性对照（环磷酰胺40mg/kg体重，腹腔注射）。灌胃给予受试药物，每天一次，连续5天。受试药物后的第15天脱臼处死、制片。于处死采集样品前4h腹腔注射4.0mg/kg秋水仙素。取组织，制备悬浮液，用姬姆萨染液染色，计数畸变细胞：对每只动物选择100个分散良好的中期分裂相，在显微镜油镜下进行读片。在读片时应记录每一观察细胞的染色体数目，对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。所得各组的染色体畸变率用X2检验进行统计学处理，以评价试验组和对照组之间是否有显著差异。

（2）小鼠畸形试验。用体重25g-30g的性成熟雄性小鼠25只，随机分为5组。以1.5mg/kg体重剂量的丝裂霉素C（经口给予）为阳性对照，10%吐温80水溶液为溶剂对照，试验用样品设1.0g/kg、2.0g/kg、4.0g/kg体重3个剂量组。每日灌胃一次，灌胃容量为10mL/kgBW，连续5天，末次灌胃后30天处死动物，取附睾制片，伊红染色，高倍镜下检查小鼠的形态，每组计数5只动物，每只动物计数1000个结构完整的，计算畸变发生率（以百分率计），并进行统计处理。

（3）胎鼠致畸试验。25g一30g的孕鼠25只，随机分为5组。以1.5mg/kg体重剂量的丝裂霉素C（经口给予）为阳性对照，10%吐温80水溶液为溶剂对照，试验用样品设1.0g/kg、2.0g/kq、4.0g/kg体重3个剂量组。孕鼠处死和一般检查：小鼠于妊娠第20d处死。剖腹检查卵巢内黄体数，取出子宫，称重；检查活胎、早期吸收和死胎数；活胎鼠检查；胎鼠骨检查；胎鼠内脏检查。

1.2.6 数据处理

采用SPSS软件进行数据处理。对计量资料采用单因素方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值

2 结果

2.1 急性毒性

BALB/C二月龄雄性小鼠10只，经口给予10g/kg体重的二氧化碳基降解塑料水悬液，间隔6小时重复给予一次。连续观察14天，未发现小鼠出现毒负作用症状；未发现小鼠出现死亡情况。实验表明经口给予二氧化碳基降解塑料LD50>10g/kg，属于实际无毒。表明二氧化碳基降解塑料不会对生物产生急性毒性。

2.2 亚慢毒性试验（90天喂养试验）

对二氧化碳基降解塑料进行大鼠90天喂养试验。试验过程中未见动物有明显异常表现。试验期间大尉舌动自如、毛发光亮、饮水、进食、大小便正常。二氧化碳基降解塑料对各剂量组大鼬的体重、进食量及食物利用率与对照组比较，雌、雄性均无显著性差异（P>0.05）。临床检查、血液学检查、血液生化学检查、脏器称量等结果表明各检验项目的实验与对照组比较，差异不显著（P>0.05）。大体各检查各剂量组大鼠共80只，雄、雌各半。剖检后肉眼观察，心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、（卵巢）、脑等主要脏器的颜色、形状、大小等均未见明显异常。病理组织学检查结果表明对照组和高剂量实验组雌、雄性大鼠的肝、肾、胃、肠、脾、、卵巢均未见明显损伤性病理变化和与二氧化碳基降解塑料有关的病理组织学改变。

2.3 突变毒性

2.3.1 Ames试验

用二氧化碳基降解塑料进行Ames试验。各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照组回变菌落数2倍以上，亦无剂量―反应关系，对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株试验菌株，在加与不加肝微粒体酶活化系统时，结果均为阴性，而且试验结果可重复，说明二氧化碳基降解塑料无致突变活性。

2.3.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验

对二氧化碳基降解塑料进行小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。各剂量组两种性别小鼠骨髓多染红细胞与成熟红细胞的比值（PCE/RBC）在1.1 6-1.23之间，未见试验用样品对两种性别小鼠的骨髓细胞增殖有抑制作用。各剂量组雌、雄小鼠骨髓多染红细胞微核发生率与样品溶剂对照组比铰均无显著性差异（P>0.05）；而环磷酰胺组与样品溶剂对照组比较，有显著性差异（见图1）。说明该二氧化碳基降解塑料未使小鼠嗜多染红细胞微核率发生改变。

2.3.3 小鼠骨髓染色体畸变试验

经口给予小鼠2.0g/kg体重、4.0g/kg体重二氧化碳基塑料5天后，与溶剂对照组比较，小鼠骨髓染色体畸变细胞率在两个剂量组与溶剂对照组组间比较，均无显著性差异（P>0.05）。表明聚乳酸在2.0g/kq体重、4.0g/kq体重剂量范围内无致骨髓细胞突变作用。二氧化碳基塑料对小鼠体重增长无不良影响。

2.4 遗传毒性试验

2.4.1 小鼠染色体畸变试验

昆明种健康清洁级雄性小鼠（25g-30g）进行小鼠染色体畸变试验。经口给予小鼠2.0g/kgBW、4.0g/kgBW聚二氧化碳基塑料5天后，观察结果显示在本实验剂量范围内聚二氧化碳基塑料不引起小鼠初级精母细胞染色体畸变数增加，说明聚二氧化碳基塑料在2.0g/kgBW、4.0g/kgBW剂量范围内无致生殖细胞突变作用（见图2）。聚二氧化碳基塑料对小鼠体重增长无不良影响。

2.4.2 小鼠畸形试验

对二氧化碳基塑料进行小鼠畸形试验。各剂量组小鼠畸形发生率与样品溶剂对照组比较无显著性差异；而丝裂霉素C组小鼠畸形发生率与样品溶剂组比较，有显著性差异（见图3）。未见二氧化碳基塑料对雄性小鼠生殖细胞有明显损伤作用。

2.4.3 胎鼠致畸试验

1g/kg BW剂量组的聚二氧化碳基塑料对孕鼠体重、子宫总重，胎鼠体重、身长、胎盘重及着床率、活胎率、外观畸胎率、骨骼畸胎率、内脏畸胎率无明显影响。即在1g/kgBW剂量未发现聚二氧化碳基塑料有致畸作用。

结语

二氧化碳基塑料经大鼠口最大耐受剂量均大于10.0g/kgBW，且未发现亚急性毒性，属实际无毒物质。AM ES实验未发现二氧化碳基塑料具有致突变性毒性，二氧化碳基塑料每天灌胃10mL/kg体重，5天后小鼠骨髓嗜多染红细胞微核、染色体畸变作用为阴性，表明受试物无致突变活性。遗传毒性实验表明，二氧化碳基塑料没有遗传毒性作用。

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