丙型肝炎病毒NS3蛋白对QSG7701细胞survivin的影响

【摘要】 目的 观察丙型肝炎病毒ns3蛋白对qsg7701细胞survivin的影响及其与细胞凋亡的关系,以探讨HCV NS3蛋白是否通过调节survivin的表达来参与对细胞凋亡的调控,进而参与HCV相关性肝癌的发生。方法 采用Western blot、免疫细胞化学检测血清饥饿前后细胞survivin蛋白表达的变化,采用TUNEL法检测血清饥饿前后细胞凋亡的变化。结果 HCV NS3蛋白促进QSG7701细胞survivin的表达,血清饥饿诱导凋亡后,survivin表达降低,HCV NS3蛋白亦表现出促进survivin表达的作用,效果呈浓度依赖性和时间依赖性。经血清饥饿诱导凋亡后,HCV NS3蛋白抑制凋亡。结论 HCV NS3蛋白可能通过促进QSG7701细胞survivin的表达从而抑制细胞凋亡,对HCV相关性肝癌的形成有一定作用。

【关键词】丙型肝炎病毒;NS3蛋白;survivin;细胞凋亡

Effects of HCV NS3 protein on the expression of survivin in QSG7701 cell

SUN Shu-yan,LIANG Fen-hua,HU Zong-jiang,et al.Department of Pathology,The Ri Zhao People’s Hospital,Shandong,Ri zhao 262300,China

【Abstract】 Objective To study the regulation of HCV NS3 protein on the expression of survivin protein in QSG7701 cell and the interacion with apoptosis for investigating carcinogenesis mechanism of HCV NS3 protein in human liver cell. Methods Apoptosis induced by serum starvation or not,the expressions of survivin protein are detected by Western Blot and immunocytochemistry,the apoptosis indexes are examined by TUNEL. Results HCV NS3 protein activates the expression of survivin in QSG7701 cell. After apoptosis induced by serum starvation,the expressions of survivin are down-regulated. HCV NS3 protein also activates the expression of survivin which exhibits the tendency of time and concentration in QSG7701 cell. At the same time,HCV NS3 protein inhibits apoptosis induced by serum deprivation in QSG7701 cell. Conclusion HCV NS3 protein inhibits apoptosis by up-regulating the expression of survivin protein in QSG7701 cell,contributes to m alignant transformation of hepatocytes and hepatocellular carcinogenesis related HCV.

【Key words】 Hepatitis virus C; NS3 protein; Sruvivin; Apoptosis

近来研究认为凋亡是肿瘤中普遍的现象,凋亡抑制与肿瘤的发生、发展及预后等密切相关。Survivin称为生存素或存活素,属抑制凋亡基因家族(IAP)的新成员,具有不同于IAP家族其他成员的独特性质和结构,表达于胚胎细胞和恶性肿瘤细胞,并且在G2/M期特异性表达。这种独特的表达特性使其成为恶性肿瘤研究的热点。已有研究表明,HCV NS3蛋白与HCV相关性肝癌的发生密切相关[1-3],关于HCV NS3蛋白与survivin之间是否有关联的研究国内外目前尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料 转染质粒pcDNA3.1-NS3并稳定表达HCV NS3蛋白的QSG7701细胞(QSG7701/NS3)为本实验室自存,水浴复苏后培养于含10%小牛血清的DMEM培养液中,培养温度为37℃,CO2浓度为5%。

1.2 试剂 抗HCV NS3多克隆抗体(美国Santa Cruz公司) ,抗survivin单克隆抗体 (美国Cell Signalling公司) ,TUNEL试剂盒(美国R&D公司),二抗、S-P试剂盒(北京中杉)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 为避免单个克隆带来实验结果的偏差,选3株QSG7701/ NS3单克隆细胞进行实验,并与QSG7701/ pcDNA3.1细胞和未转染的QSG7701细胞同时进行。实验分为5组:① 未转染的QSG7701;②空白质粒pcDNA3.1转染的QSG7701(QSG7701/ pcDNA3.1);③,④,⑤ HCV NS3蛋白表达质粒pcDNA3.1/NS3转染的QSG7701(QSG7701/NS3-1,-2,-3)。

1.3.2 血清饥饿处理 各组细胞对数生长期时分别用0%,1%,2%血清饥饿48 h,72 h,96 h。

1.3.3 Western印迹 参照《分子克隆》的实验步骤进行总蛋白质的提取,BCA Protein Assay Reagent定量,取100μg已定量的总蛋白在15%SDS-PAGE电泳,电转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂奶粉封闭1 h,TBS/T洗膜,3 ×5 min,加入一抗,室温下孵育12～16 h,TBS/T洗膜,3 ×5 min,加二抗,37℃孵育3 h,TBS/T洗膜,3 ×5 min,DAB显色。利用UTHSCSA Imagetool Analysis software测定Western Blot条带净灰度值,并与内参照 β-actin测定结果相比较,计算其比值。

1.3.4 免疫细胞化学检测 免疫细胞化学SP法检测各组细胞内survivin蛋白的表达和细胞内定位。阳性细胞判断:以胞浆和/或胞核出现淡黄至棕黄色为阳性。阳性细胞着色强度按其染色强度分为3级:表达弱阳性(+),染色强度为弱阳性或仅个别细胞呈中至强阳性;表达强阳性(+ + +),染色强度中至强阳性;中度阳性(+ +),即阳性表达强度介于弱阳性和强阳性之间;无着色者为阴性。

1.3.5 原位末端标记法(TUNEL法)检测凋亡 常规细胞传代,接种于铺有无菌盖玻片的6孔培养板,按原位末端标记检测试剂盒要求操作。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。400倍镜下随机计数10个视野(总数>1000个细胞)中阳性细胞所占的百分比作为细胞凋亡指数(apoptotic index AI)。

1.3.6 统计学方法 采用方差分析,以P

2 结果

2.1 HCV NS3蛋白在QSG7701细胞中的表达 Western印迹检测结果显示3株QSG7701 /NS3细胞中均检测到HCV NS3蛋白的特异性条带,而QSG7701 /pcDNA3.1细胞和未转染的QSG7701 细胞中均未见HCV NS3蛋白的表达,证实QSG7701 /NS3细胞稳定表达HCV NS3蛋白。

2.2 HCV NS3蛋白对QSG7701细胞survivin蛋白表达的影响 Western印迹检测结果显示survivin蛋白在5组细胞都表达,在3株转染组细胞中表达较强,未转染组和空白转染组表达较弱,平均为转染组的84.50%,79.47%。表明HCV NS3蛋白促进survivin的表达。

2.3 细胞凋亡对QSG7701/NS3细胞survivin蛋白表达的影响 分别经0%,1%,2%血清饥饿72h,Western印迹在各组细胞中均检测到survivin蛋白的特异性条带(图1),5组细胞经不同浓度血清处理后都表现出相同的趋势,即未转染组与空白转染组survivin蛋白的表达较3株转染组细胞的表达弱,表明血清饥饿诱导细胞凋亡后HCV NS3蛋白亦促进survivin的表达。

任取一株转染组细胞,在细胞对数生长期时分别用0%,1%,2%血清饥饿48 h,72 h ,96 h。可见survivin蛋白表达受抑制,且呈现时间依赖性和剂量依赖性。血清饥饿时间越长,survivin表达逐渐降低,血清浓度越低,survivin表达降低越明显。

图1 Western印迹检测显示1%血清作用72 h各组细胞survivin的表达

1-5泳道分别为QSG7701,QSG7701/pcDNA3.1,QSG7701/NS3-1,2,3

2.4 Survivin在细胞内的表达和定位 免疫细胞化学结果显示survivin表达于细胞质,核内未见阳性表达,转染组表达较强,呈强阳性表达。根据染色强度未转染组,空白转染组与三株转染组可记为2+,2+,3+,3+,3+。经0%血清饥饿72h后,survivin蛋白表达降低,部分细胞呈弱阳性表达。根据染色强度依次可记为1+,1+,2+,2+,2+。

2.5 原位末端标记法检测细胞凋亡 为明确HCV NS3蛋白与QG7701细胞凋亡有关联,笔者用TUNEL法检测各组的凋亡细胞,结果发现各组的凋亡细胞很少,5组凋亡细胞指数无显著性差异(P>0.05)。0%血清处理72h,QSG7701,QSG7701/pcDNA3.1,QSG7701/NS3-1,2,3组平均凋亡指数分别为41.51%,45.31%,31.60%,24.30%,27.58%(图2)。未转染组,空白转染组分别与三株转染组有显著性差异(P0.05)。

图1 原位末端标记法检测0%血清饥饿72 h QSG7701/NS3细胞的凋亡×400

3 讨论

Survivin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族新成员。正常情况下,survivin仅表达于胚胎组织和发育中的胎儿组织,在终末分化的成人组织中表达缺失,但在多种恶性肿瘤组织中可检测到不同程度和频度的survivin阳性表达。Survivin的表达可促进细胞表型的恶性转化,使细胞逃避生长监控,抑制细胞凋亡,成为某些恶性肿瘤发生的关键因素[4-6]。

Survivin是一个进化过程中高度保守的蛋白分子,可对多种刺激诱导产生的凋亡起抑制作用。HCV NS3与HCV相关性肝癌密切相关,已研究证实HCV NS3表达显著增加NIH3T3细胞端粒酶活性,导致宿主细胞恶性转化[3]。将HCV NS3 区基因转染到NIH3T3和QSG7701细胞中,细胞表型改变,倍增时间明显缩短,且接种裸鼠后成瘤[1,2]。结果表明QSG7701/NS3细胞中survivin蛋白表达上调,用原位末端标记法检测发现细胞的凋亡指数也很低,这表明HCV NS3蛋白在QSG7701细胞中的表达促进survivin基因的上调、抑制细胞凋亡,HCV NS3蛋白可能通过对survivin的调节参与对细胞凋亡的调控。经血清饥饿诱导细胞凋亡,QSG7701/NS3细胞凋亡指数明显上升,同时凋亡细胞survivin蛋白的表达亦下降。这种变化趋势符合survivin的表达与细胞凋亡之间呈负相关的现象。同时进一步证实survivin在HCV相关性肝癌细胞的凋亡调控方面可能发挥着重要作用,部分解释HCV NS3蛋白参与HCV相关性肝癌的发生。

Survivin含有长度为70个氨基酸左右的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复序列(BIR),survivin可通过该结构域与活性caspase3、caspase7结合,抑制其活性,从而抑制多种刺激因子诱导的凋亡[7]。对QSG7701/NS3细胞进行不同浓度、不同时间处理,survivin的表达呈现时间依赖性和剂量依赖性。饥饿时间越长,survivin表达降低越明显;血清浓度越低,survivin表达降低越明显。这与检测到的活性caspase3的表达趋势正好相反[8],即survivin表达水平降低越明显,caspase3酶活性升高越显著。这提示血清饥饿降低QSG7701/NS3细胞中凋亡抑制蛋白survivin的表达,减少survivin与caspase3的结合,使后者的DEVD切割酶活性充分释放出来,引起PARP裂解,最终导致凋亡。

Survivin作用于凋亡途径的汇集点,同时又仅在肿瘤组织异的存在,使其成为抗癌治疗最理想的靶点之一。HCV NS3蛋白促进凋亡抑制蛋白survivin的表达,抑制细胞凋亡;在血清饥饿处理后,survivin的高表达受抑制,细胞最终凋亡。这提示可采用基因技术(如survivin反义寡核苷酸转染)封闭survivin蛋白的表达,解除HCV NS3蛋白对survivin的上调作用,诱导HCV相关性肝癌细胞凋亡,达到治疗目的。

参考文献

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