花生自身基因组原位杂交分析

摘要：利用自身基因组荧光原位杂交技术，对花生（Arachis hypogaea L.）进行自身基因组原位杂交分析。结果显示，杂交信号沿所有染色体的全长分布，染色体着丝粒区、近着丝粒区和部分DAPI深染的区域存在强烈的杂交信号，染色体远端的杂交信号偏弱，染色体上存在少数未观察到杂交信号的DAPI深染区域。花生自身基因组原位杂交存在明显的非均匀染色体杂交带型，这说明基因区成簇分布在小的染色体区域并被重复序列间隔开。

关键词：花生（Arachis hypogaea L.）；自身基因组原位杂交；重复DNA序列；基因组组织

中图分类号：S565.2；Q943.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0527-03

高等植物核基因组的一个显著特征是含有大量的重复序列，如在玉米基因组中，重复DNA序列占85%以上[1]。重复序列是基因组大小差异和复杂性增加的主要原因[2]。根据重复序列在基因组中组织方式的不同，可初步分为串联重复序列（Tandem repetitive sequence）、散在重复序列（Dispersed repetitive sequence）和片段重复序列（Segmental duplication）。弄清不同类型重复序列沿染色体的物理分布是解析植物基因组组织和进化的关键之一。

全基因组测序方法是解析基因组组织和结构最准确的方法，但目前全基因组测序仅在模式植物和少数重要的作物中开展。基因组原位荧光杂交（Genomoic in situ hybridization，GISH）是荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）技术的一种，能直接揭示DNA序列沿染色体的分布模式，是研究基因组结构特征的方法之一。对拟南芥[3]、水稻[4-6]、大麦[7]、甘薯[8]等植物自身基因组原位杂交（self-Genomoic in situ hybridization，self-GISH）的研究表明，自身基因组原位杂交技术是揭示植物基因组中重复序列在染色体上的分布以及基因组组织的有效方法。

花生（Arachis hypogaea L.）是重要的植物性食用油和蛋白质来源，由花生属（Arachis）的二倍体物种杂交加倍形成的异源四倍体（2n=4X=40，AABB），基因组大小约为2 800 Mb[9]。对花生染色体核型[10]、荧光显带[11]及rDNA物理定位[12，13]已有报道，但对花生基因组重复DNA序列的组织和结构并不明晰。本研究拟用自身基因组原位杂交技术，初步揭示花生基因组重复DNA序列沿染色体的分布及与重复DNA相关联的染色质分化，为探究花生基因组的组织及结构提供更多的资料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为珍珠豆型栽培花生中花8号，购于市场。

1.2 方法

1.2.1 染色体的制备 染色体制片按Song等[14]的方法稍加改进。取生长旺盛的根尖，室温用饱和α-溴萘水溶液处理3 h后用新鲜卡诺固定液固定。用2%（质量分数）的纤维素酶和2%（质量分数）的果胶酶28 ℃酶解，经水洗、固定等步骤后采用火焰干燥法制片，-20 ℃保存备用。

1.2.2 基因组DNA的提取和探针标记 花生基因组DNA采用CTAB法提取。通过切口平移的方法用生物素-dUTP（biotin-11-dUTP）标记探针。切口平移标记反应体系含有基因组DNA 500 ng，DNA PolymeraseⅠ（Takara） 5 U，DNA PolymeraseⅠ的 10×Buffer 4 μL ，DNaseⅠ（Takara） 0.001 U，dATP、dGTP、dCTP各0.1 mmol，Bio- dUTP （Biotin-11-dUTP ∶ dTTP为 1∶2） 0.1 mmol，加ddH2O至40 μL，14 ℃反应2 h，加2 μL 0.5 mol/L EDTA 80 ℃保温5 min终止反应。切口平移标记的DN段用2%的琼脂糖检测。

1.2.3 原位杂交及检测 原位杂交及信号检测参照Li等[15]的方法并略作修改。染色体制片65 ℃烤片后，经Rnase A（37 ℃，1 h）处理，接着用2×SSC配制的70%甲酰胺溶液70 ℃处理2.5 min，用75%乙醇、95%乙醇和无水乙醇在-20 ℃各脱水5 min，然后置室温下干燥。每张片子加入40 μL杂交液，含100 ng标记的DNA、50%的去离子甲酰胺（Sigma）、10%的硫酸葡聚糖（Sigma）、0.1% SDS、2×SSC、4 000 ng sssDNA，用22 mm×22 mm的盖玻片盖片，90 ℃共变性5 min，于保温皿中37 ℃杂交24～48 h。杂交后的片子在42 ℃用2×SSC配制的20%甲酰胺溶液洗2次，每次5 min，接着用2×SSC在室温及37 ℃各洗10 min，1×PBS室温洗1次，加入Streptavidin-Cy3，37 ℃下温育30 min，再用1×PBS室温洗3次，每次5 min。

1.2.4 图像检测及分析 染色体制片用5 μL/mL 的荧光染料DAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）复染，加抗淬灭剂Vectorshield（Vector Lab），用Olympus BX60 显微镜观察荧光原位杂交信号，用Photometrics SenSys CCD（charge coupled device）1400E照相装置和Metamorph 4.6.3（Universal Imaging Crop）软件俘获图像，用Photoshop 7.0.1软件进行图片处理。

2 结果与分析

以中花8号基因组的总DNA为探针对其自身染色体进行杂交，图1显示了中花8号自身基因组荧光原位杂交（self-GISH）结果。对染色体中期分裂相杂交结果进行分析，结果（图1a）显示杂交信号密集的沿所有染色体的长轴分布，单从杂交信号就可以看出染色体的轮廓，染色体着丝粒区、近着丝粒区和部分DAPI深染区域存在强烈标记的杂交信号。在强烈标记区域能观察到交替分布的弱标记区域。同时可以观察到染色体远端的信号偏弱，染色体上存在少数未被杂交的区域。增强的信号散布于轻度标记的或非标记的染色体区，表现出染色体的非均匀杂交。大部分DAPI深染的染色质区域有明显增强的信号，但是还有几个DAPI着色深的异染色质区域没有杂交信号。

为了排除DAPI着色深的异染色质区域没有杂交信号是由于染色质凝缩程度过高而导致探针无法与目标区域的DNA杂交，对染色质凝缩程度较低的间期细胞核的杂交信号进行了分析。结果（图1b）表明，杂交信号分布于核区所有范围。增强的杂交信号和轻度标记的杂交信号交替分布，但可以观察到增强的信号集中分布于核的一侧，增强的杂交信号和轻度标记的杂交信号分别占据间期核的不同区域。大部分DAPI着色深的异染色质区域有明显增强的信号，但还是有几个DAPI着色深的异染色质区域没有检测到杂交信号，这说明染色质凝缩程度并不是决定这几个区域能否杂交的关键因素。

3 讨论

拟南芥、甘蓝、大麦等其他植物[3，7，8，16-18]自身基因组荧光原位杂交图型与转座子、反转座子等重复DNA 序列的FISH图型相似，证实了基因组荧光原位杂交信号主要来自重复DNA 序列。有研究认为，自身基因组荧光原位杂交图型能在一定程度上反映植物基因组重复序列和基因在染色体水平上的组织情况，杂交信号强烈的区域应当富含重复序列，为异染色质区域即基因贫乏区；轻度标记或者非标记的区域则应当是常染色质区即基因富集区[7，19]。拟南芥、水稻、高粱等自身基因组荧光原位杂交结果显示，基因组中的重复序列集中分布在近着丝粒的异染色质区域，基因则分布在染色体远端缺乏重复序列的常染色质区域，这与用其他方法分析的结论基本吻合[20，21]。

在本研究中，中花8号自身基因组荧光原位增强的信号主要位于DAPI深染区、着丝粒区、近着丝粒区，说明这些区域主要由重复DNA构成。增强的信号散布于轻度标记的或非标记的染色体区域，说明基因区成簇分布在小的染色体区域并由重复序列间隔开。这与其他具有大基因组植物的组织模式基本一致[7，18，19]。

DAPI是双链DNA 特异性染料，与富含AT碱基对区域结合量大而发出较强的荧光，一般推测DAPI深染区是异染色质区。花生染色体的DAPI带纹特征可以为花生染色体的识别和鉴定提供特征，为研究花生的起源提供更多的染色体资料[11]。值得注意的是，在花生自身基因组原位杂交过程中，有几个DAPI着色深的异染色质区域还是没有检测到杂交信号。玉米核仁组织区和染色质纽在自身基因组原位杂交中也出现阴性信号[7]。类似的情况在其他几个植物中也检测到[18，22，23]。有学者认为这是重复序列自我封阻阻止了某些小部分的重复DNA在特定杂交条件下与对应染色体区域的杂交。从本实验中期染色体和间期核杂交的结果来看，某些高度重复序列在染色质包装的早期就形成了复杂的高级结构，封阻了探针的进入和杂交。

已有很多证据表明，重复序列对基因的调控和表达有一定的作用，异染色质的高级结构可能对染色质的包装起到支持和脚手架的作用[24]。所以花生染色体上基因区与重复DNA序列区的分布特征为理解花生基因的组织和进化动力提供了一些有益数据。

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