运动对肥胖大鼠血浆和下丘脑NPY蛋白及其基因表达的影响

摘要：目的：一次性运动对肥胖大鼠摄食量、血清学指标、血浆和下丘脑NPY蛋白及其基因表达的影响。探讨运动影响摄食量和体重的分子生物学机制。方法：肥胖建模成功大鼠分为对照组、即刻组、1h组、3h组、12h组和24h组，分别在一次性跑台运动后不同时间段观察大鼠进食量并测试相关指标。结果：一次性运动后肥胖大鼠摄食量明显下降，血糖和血脂等在运动后即刻没有明显变化，在运动后的恢复期开始明显下降。恢复后期才逐渐恢复到正常水平。血浆NPY水平显著下降，下丘脑NPY水平明显上升，而下丘脑NPY基因表达变化不明显。结论：肥胖大鼠运动后摄食量下降；下丘脑NPY分泌增加而合成没有明显增加；下丘脑NPY蛋白增加可以促进机体运动后摄食，防止能量的进一步消耗，有利于运动后的能量恢复。

关键词：肥胖；运动；摄食量；神经肽Y

中国分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1007-3612(2009)01-0062-03

体重主要是由运动消耗能量和食物摄取平衡来决定的。而运动又对运动后的食物摄取有较大影响，因此运动、运动后的食物摄取和体重三者是相互循环关联的。本研究通过运动对肥胖大鼠血浆和下丘脑NPY及其基因表达的影响来观察运动对肥胖大鼠摄食量影响，进一步探讨运动影响肥胖大鼠摄食量的分子生物学机制。

1　实验材料及方法

1.1　实验动物及分组　将肥胖建模成功SD大鼠46只按照体重级别分为8个等级，然后从每个等级随机抽取一只大鼠分笼，每笼8只分为即刻组(EO)、1h组(E1)、3h组(E3)、12h组(E12)和24h组(E24)，最后一笼6只作为对照组(C)。这样可以尽量保证各组大鼠在实验前体重上没有明显差异。

1.2　实验对象运动方式　运动方式：大鼠专用电动跑台，坡度5％，速度20m／min，运动时间40 min。在正式跑台运动取材前，大鼠适应性训练3d，1次／d，每次20min,让大鼠能够适应跑台训练以完成实验。第四天严格按照训练计划进行正式训练，跑台结束后正常进食和饮水。

1.3　测试样本的采集与处理　即刻组(EO)：大鼠在运动完以后立即2％戊巴比妥钠0.25 mL／100g行腹腔麻醉。用10mL注射器腹主动脉抽血，然后取2mL注入含置有10％EDTA-Na2(30μL)和抑肽酶(40μL)一次性试管混匀。4℃离心(4000r／min)15min，分离血浆至1.5mLEP管，-20℃以下保存待测，用于RIA；余血注入10 mL的一次性离心管，室温下静置2h，3000 r／min共20min离心，分离血清，-20℃保存待测；将大鼠沿颅骨正中剪开，暴露大鼠全脑并剥脱大鼠下丘脑，将大鼠下丘脑沿正中线纵向切开，左边一半用锡纸包好冻存-70℃用于RT-FCR；右边一半在煮沸的生理盐水煮5min，滤纸吸干，分析天平称重，加1 mol／LHCI0.5mL制成匀浆，室温下静置100rain，然后加1mol／LNaOH 0.5mL中和，4℃离心4000r／min，15min，取上清液保存-20℃用于RIA。

1h组(E1)：大鼠在运动完以后1h宰杀，取材步骤同上。

3h组(E3)：大鼠在运动完以后3h宰杀，取材步骤同上。

12h组(E12)：大鼠在运动完以后12h宰杀，取材步骤同上。

24h组(E24)：大鼠在运动完以后24h宰杀，取材步骤同上。

对照组(C)：鼠笼静养直接宰杀，取材步骤同上。

1.4　指标测试与方法

1.4.1　一般情况　运动完以后观察大鼠进食情况，精神状态等。对一次性运动组和肥胖对照组大鼠同时给予一定量的饲料，在各运动组大鼠宰杀前同时称重运动组大鼠和对照组大鼠剩余饲料，计算大鼠在运动后至宰杀前一段时间的进食量，并与对照组大鼠进食量进行比较。

1.4.2　血清学指标　测试大鼠一次性运动后不同时间段血糖、血脂、血胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的变化，以探讨一次性运动肥胖大鼠在不同时间段血清学指标变化情况。血清学指标采用全自动生化分析仪检测。

1.4.3　血浆和下丘脑NPY的测试方法 采用放射免疫学(RIA)方法测试，NPY试剂盒购于上海第二军医大学神经生物学教研室，所有测试由上海第二军医大学神经生物学放免实验室完成。RIA实验严格按照说明书操作步骤进行操作。NPY试剂盒灵敏度＜5 pg／tube，可测范围2.5-1280pg/tube，批内CV＜10％，批间CV＜10％。

下丘脑NPY mRNA的测试方法：基因表达采用半定量RT-PCR方式测试。Trizol和逆转录酶：美国invitrogen公司；ExTaq酶：日本Takara公司；引物：皆由上海赛百盛生物公司合成。

1.5　数据统计方法　所有数据采用平均数±标准差(χ±s)表示，组间比较采用SPSS11.5统计软件包进行独立样本T检验。显著性水平为P＜0.05，非常显著性水平为P＜0.01。

2　结果

2.1　一次性运动对肥胖大鼠摄食量的影响　一次性运动后，除了即刻组没有观察大鼠进食量外，对其它各组大鼠在运动后到宰杀前的进食量进行了统计，发现在运动后各组大鼠摄食量与对照组相比明显降低。E1组大鼠在运动后的1h内几乎未进食，与对照组相比下降100％；E3组大鼠在运动后平均每只进食0.5g，相比对照组大鼠少进食2.5g，下降83％；E12组大鼠在运动后的12h内进食5.8g，比对照组少进食14.2g，下降率达到70％；E24组大鼠在运动后的一天之内进食9g，比对照组少进食16g，下降率为64％。一次性运动后大鼠摄食量具体情况见表1。

2.2　一次性运动对肥胖大鼠各项血清指标的影响　一次性运动后，肥胖大鼠血糖在不同时间段呈下降趋势，其中在1h组下降非常明显，其它各组只是有轻微下降趋势；血脂水平也在运动后下降，但是下降不明显，只是在12h组下降非常明显；血胆固醇水平在运动后即开始显著下降，在运动后即刻和1h下降非常明显，而其它各组下降不明显；高密度脂蛋白水平在运动后开始显著下降，在12h和24h组逐渐恢复正常；而低密度脂蛋白水平在运动后有上升趋势，但是上升幅度不明显，只是在24h组有显著上升。一次性运动对肥胖大鼠血液指标的具体影响见表2。

2.3　一次性运动对肥胖大鼠血浆NPY的影响　NPY血浆浓度在一次性运动后不同时间段几乎都有显著性下降，至24h仍未能恢复至运动前水平。具体情况见表3。

2.4　一次性运动对肥胖大鼠下丘脑NPY及其基因表达的影

响　一次性运动后肥胖大鼠下丘脑NPY早期阶段就显著上升，如即刻组、1h组、3h组和12h组都显著升高。而在24h组正好回复到对照组水平，而NPY mRNA基因表达在不同时间段变化不明显。一次性运动对肥胖大鼠下丘脑NPY及基因表达的影响具体情况见表4。

3　结果讨论

肥胖大鼠在运动后摄食量马上开始下降，在12小时和24小时才逐渐恢复，可能运动对肥胖大鼠运动和消化系统血液的重新分配有关，也可能是因为运动造成肥胖大鼠下丘脑摄食调控中枢一些内分泌指标的变化造成。

血糖和血脂在运动后即刻没有明显变化，只是在恢复期开始下降明显，表明肥胖大鼠在运动后的恢复期继续动员糖和脂肪供能，肥胖大鼠体内存在有足够的糖原和脂肪，40min的运动使肥胖大鼠体内能量动员加强，大量消耗体内多余糖原和脂肪，因此跑台运动没有使肥胖大鼠血糖、血脂降低；在恢复后期，由于摄食补充，血糖和血脂才逐渐恢复到正常水平。

NPY是1982年由Tatemoto首次从猪脑中分离得到，现在已经知道它普遍存在于哺乳动物的大脑中。NPY神经元在中枢主要分布于下丘脑、海马、孤束核和大脑皮层等部位，其分支可以投射到侧脑室的室旁核等部位发挥其生理学作用；在外周循环NPY主要来源于肾上腺髓质，另外肝脏、心脏、脾脏和血管内皮细胞也有少量存在，NPY主要分布于交感神经系统，在副交感神经系统也有适量分布。NPY广泛分布于中枢神经系统和外周组织。具有多种生理功能，但NPY的促进摄食功能引起了人们极大的兴趣。在中枢神经系统中，NPY除了具有促进动物采食外，还影响激素分泌、、呼吸功能、电解质平衡、体温调节、生物节律、学习记忆及情绪影响等多种生物功能。外周血液中的NPY大多起源于交感神经元，它能引起血管收缩和促进血细胞有丝分裂。并涉及心血管功能。

运动使肥胖大鼠各个时间段血浆NPY显著下降，而下丘脑NPY显著上升，但对下丘脑组织NPY基因表达没有明显影响。Chen给予SD大鼠大强度跑台运动7周，开始5周适应性训练(每周5次，每次20min，速度递增至35m／min)，后两周维持35m／min的速度，每周7次，每次25min跑台运动，在最后一次运动前、运动后即刻、运动后30min和运动后180min通过免疫印迹杂交技术观察大鼠下丘脑各部位NPY蛋白表达情况，发现大鼠在运动后不同时间段下丘脑VMN、PVN和DMN的NPY免疫阳性细胞显著增加，作者认为大鼠下丘脑各部位NPY的表达增加可以防止能量进一步消耗，有利于运动后的能量恢复。此研究结果与本人一致。但是Karamouzis I在16位年轻人进行长距离(25km)的游泳比赛中(游泳前或者游泳途中可以进食)，测试运动员运动前和运动后即刻血浆NPY、leptin、血糖和游离脂肪酸浓度，发现运动员血浆leptin明显降低，而血浆NPY、血糖和游离脂肪酸浓度显著升高，与leptin浓度明显负相关。Bjcanebekk A让大鼠在轮子上跑步5周(轮子周径长1.07m，每天48圈)，通过免疫组化杂交技术也观察到大鼠海马CA4区和齿状回(dentate gyms，DG)区域NPY mRNA表达明显增加。这些结果与本人研究不一致可能是因为实验对象不同、运动方式、运动强度和运动量不同所致。本人认为肥胖大鼠在运动后刺激大鼠下丘脑NPY释放增加，而合成不受影响，大鼠下丘脑NPY的表达增加可以促进机体摄食，防止能量进一步消耗，有利于运动后的能量恢复，而血浆NPY浓度的下降可能是受到运动后in- sulin、去甲肾上腺素和体温升高的影响，其具体降低机制还需要进一步探讨。

4　结论

通过对肥胖大鼠一次性运动后不同时间段摄食量、血糖、血脂等血清学指标，血浆和下丘脑NPY等内分泌指标蛋白和基因的检测。得出如下结论：

1)一次性运动之后，肥胖大鼠摄食量显著降低，在12h开始恢复到正常对照水平； 2)运动之后血糖等基础指标开始下降，在3h开始恢复到正常对照水平；

3)一次性运动后不同时间段可以降低血浆NPY浓度，升高下丘脑NPY浓度，对NPY基因表达没有影响。这种变化可以促进机体摄食，防止能量的进一步消耗，有利于运动后的能量恢复。