姜黄素抑制小鼠生殖器官氧化产物生成的研究

【摘要】目的：探讨姜黄素对氧化应激小鼠子宫、卵巢组织脂质过氧化水平的影响。方法： 昆明种雌性成年小鼠40只，随机分成正常对照组，0 mg/kg Cur组，100 mg/kg Cur组，200 mg/kg Cur组，连续用药21天，实验结束后测定小鼠子宫、卵巢组织以及血清中丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）的含量。结果：100 mg/kg Cur组，200 mg/kg Cur组血清、子宫以及卵巢氧化应激产物ROS、MDA与砷暴露组相比均有降低，具有明显统计学差异（P

【关键词】姜黄素；氧化应激；卵巢；子宫；小鼠

Inhibit effect of curcumin on lipid peroxidation product in the reproductive organs of miceWANG Xiaoning， ZHANG Changjun， ZHANG Ying， DIAO Honglu. Center of Reproductive Medicine， Affiliated People Hospital of Hubei Medical College， Shiyan 442000， China

【Abstract】Objectives： To observe the different effect of curcumin on the markers of oxidative stress to explore the pathogenesis to offer more experimental evidence for the clinical use of cur cumin on the oxidative stress related ovarian diseases. Methods： 40 Kunming mice with two regular estrus cycles， without coitus and body-matured female were selected as research objects and were randomly divided into four groups， including control group， 0mg/kg Cur group， 100mg/kg Cur group， 200mg/kg Cur group. All rats were treated for 21days and examined by ELISA for the concentration of Reactive Oxygen Species （ROS）， Malondialdehyde （MDA） in serum， uterus and ovaries. Results： Compared with the 0mg/kg Cur， the concentrations of ROS and MDA in the serum， uterus and ovaries of 100mg/kg Cur group and 200mg/kg Cur group were decreased， the difference was significant （P

【Key words】Curcumin； Oxidative stress； Ovary； Uterus； Mouse

【中图分类号】S857.17【文献标志码】A

氧化应激起源于反应性的氧化物与生物抗氧化剂间平衡的破坏，造成活性氧浓度升高。而高浓度活性氧会破坏细胞的DNA、蛋白质和脂类，致使细胞基因、结构及功能受损，甚至导致细胞死亡[1]。许多不同的生殖状态都存在氧化应激，如子宫内膜异位症、卵子发生、卵母细胞成熟、输卵管积水、弱精症、死精症及 DNA 损伤等[2]。姜黄素（Curcumin， Cur）是从姜黄属中药莪术、姜黄、郁金等的块茎中提取出来的一种植物多酚，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种作用[3]。已有文献证明[4]，Cur具有强大的抗氧化作用。近年来已有文献报道[5]，Cur能很好地改善大鼠肝脏、肾脏以及心脏等组织氧化应激的发生。Cur[6]是一种天然无毒的物质，因此本实验利用Cur的抗氧化作用，从多种生殖系统疾病的共同发病机制之一氧化应激研究，通过观察姜黄素对小鼠子宫、卵巢组织以及血清中氧化产物MDA、ROS 的影响，探讨姜黄素对小鼠生殖系统氧化损伤保护作用的机理，为临床治疗生殖系统氧化应激引起的各种疾病提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1动物

选用湖北医药学院实验动物中心提供的健康雌性清洁级昆明小鼠40只，鼠龄6～7周，动物使用许可证编号：SYXK（鄂）2009-0021。

1.2材料

姜黄素（纯度94%）购自Sigma公司，溶剂0.5%羧甲基纤维素钠溶液由湖北医药学院附属人民医院药剂科惠赠，亚砷酸钠购自成都艾德化工有限公司，小鼠SOD、MDA测定ELISA试剂盒均购自美国R&D公司。

1.3方法

通过阴道脱落细胞涂片观察昆明小鼠动情周期，挑选连续有2个以上正常动情周期（阴道涂片为大量无核角化细胞）的小鼠，适应性喂养3d。小鼠称重后按体重配药，将姜黄素称重后用0.5%羧甲基纤维素钠溶液溶解，亚砷酸钠用蒸馏水溶解。用药前1d每鼠肌注雌二醇0.1mg/（kg・d），使动物统一处于动情期。各组分别给药，正常对照组：灌胃0mg/kg姜黄素悬浮液0.5mL（1次/d）+腹腔注射0mg/kg亚砷酸钠溶液0.5mL（1次/2d）；0 mg/kg Cur组：灌胃0mg/kg姜黄素悬浮液0.5mL（1次/d）+腹腔注射8mg/kg亚砷酸钠溶液0.5mL（1次/2d）；100 mg/kg Cur组：灌胃100mg/kg姜黄素悬浮液0.5mL（1次/日）+腹腔注射8mg/kg亚砷酸钠溶液0.5mL（1次/2d）； 200mg/kg Cur组：灌胃200mg/kg姜黄素悬浮液0.5mL（1次/d）+腹腔注射8mg/kg亚砷酸钠溶液0.5mL（1次/2d）。每天定时给药，连续给药21d。严格确保药物灌进小鼠胃内以免影响实验结果。

1.4标本的处理

第22d处死各组小鼠，采用心脏取血法在处死小鼠后直接从小鼠心脏取血0.5mL，待血液凝固后离心取上清，采用ELISA方法测定血清中MDA、ROS含量。

取小鼠左侧子宫、卵巢组织，称重后，按照1∶20（卵巢重量：PBS用量）的比例用研磨器将小鼠卵巢组织磨成匀浆，将匀浆液离心（转速3000r/min，时间20min）后取上清，采用ELISA方法按照试剂盒说明测定卵巢组织匀浆中ROS、MDA的含量。

组织形态学观察：第22d颈椎脱臼处死所有小鼠，立即解剖，取下每组小鼠右侧卵巢组织，立即置于4%甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋，4um厚度连续切片，HE染色，光学显微镜下观察各组小鼠卵巢组织学特点及差异。

1.5统计分析

采用SPSS17.0软件进行分析，所有数据均以±s表示，各组间比较采用单因素方差分析，以P≤0.05作为具有统计学差异。

2结果

2.1小鼠一般情况观察

在实验期间，各小鼠饮水、饮食、活动正常，均未出现反应淡漠、异常兴奋、少食少动、皮毛干枯等异常表现。在实验期间，各小鼠体重均呈增长趋势，体重增长由高到低依次为正常对照组（16.52±9.62）、100mg/kg Cur组（16.29±4.86）、 200mg/kg Cur组（13.02±4.19）、0mg/kg Cur组（11.75±5.88），各组相互之间相比无统计学意义（P>0.05）。 见表1。

表1各组小鼠体重变化结果组别用药前体重

（mg）处死前体重

（mg）体重增长

百分比（%）正常对照组29.44±2.2534.38±4.7816.52±9.620 mg/kg Cur组30.78±2.0634.46±3.7611.75±5.88100 mg/kg Cur组29.92±2.5434.70±1.5716.29±4.86200 mg/kg Cur组29.67±2.1533.53±2.5413.02±4.19

2.2小鼠卵巢肉眼观、卵巢组织HE染色结果

各组卵巢组织肉眼观无明显差异。卵巢组织切片结果显示，正常对照组可见成熟卵泡、次级卵泡、初级卵泡以及黄体等结构；0 mg/kg Cur组卵巢皮质变薄，间质增生，成熟卵泡稀有，闭锁卵泡增多，卵泡多呈囊性扩张，内含大量浆液性物质，极少见黄体结构。Cur干预后，闭锁卵泡减少，可见各级卵泡。见图1。图1卵巢组织肉眼观（HE染色）

2.3血清、子宫、卵巢组织中ROS含量

用亚砷酸钠造模后，引起子宫、卵巢组织匀浆以及血清中ROS含量增高，且与正常对照组相比具有明显统计学意义（P

表2血清、子宫、卵巢组织中ROS含量组别卵巢ROS含量

（IU/mg）子宫ROS含量

（IU/mL）血清ROS含量

（IU/mL）正常对照组10.71±0.91*2.71±0.35*475.97±28.02*0 mg/kg Cur组11.74±0.653.27±0.84577.82±46.64100 mg/kg Cur组10.64±1.38*2.62±0.68*445.55±28.59*200 mg/kg Cur组10.67±1.38*2.10±0.24*367.52±70.36*注：与0 mg/kg Cur组比较，* P

2.4血清、卵巢组织中MDA含量

与正常对照组相比，砷暴露组血清及子宫、卵巢组织匀浆以及血清中MDA含量增高，且具有明显统计学意义（P

表3姜黄素对小鼠血清、子宫、卵巢组织中MDA含量的影响组别卵巢MDA含量

（nmol/g）子宫MDA含量

（nmol/L）血清MDA含量

（nmol/L）正常对照组0.27±0.02*0.049±0.004*8.38±1.41*0 mg/kg Cur组0.32±0.020.060±0.0109.95±1.98100 mg/kg Cur组0.28±0.02*0.041±0.069*6.55±0.67*200 mg/kg Cur组0.27±0.04*0.032±0.005*6.22±0.73*注：与0 mg/kg Cur组比较，* P

3讨论

氧化应激损伤的生物标志物，主要是针对机体内部抗氧化系统与氧化损伤产物所确定的。ROS以及MDA是常见的氧化应激标志物。ROS是包括氧离子、自由基和过氧化物的一组反应性氧化物。ROS产生于细胞内或细胞外的各种环境因素，细胞内ROS来自线粒体、微粒体、细胞色素p450体系和膜NADPH氧化酶。细胞本身的有氧代谢过程有ROS的产生，而外源性氧化剂可以引起ROS的堆积。任何分子都能被活性氧氧化，从而发生结构及功能的改变。一般来说， ROS引起的氧化应激会导致躯体衰老，同样也可以引起生殖衰老[7]。目前已经证实[8]，ROS信号是许多基因介导疾病以及酶介导疾病的重要发生因素，它可以引发或诱导蛋白激酶、磷酸酶等介导的生物反应，进而引起疾病。Kumar 等[9]研究发现，高浓度的ROS引发线粒体DNA突变，导致线粒体功能障碍，线粒体功能障碍使得由线粒体氧化磷酸化产生的ATP降低，这些危害卵子发生过程，使卵泡的数量减少[9]。当组织处于氧化应激状态时，相应的氧化产物MDA增高，这些影响颗粒细胞类固醇激素等物质生成[10]，使组织器官功能受损。因此将卵巢、子宫中ROS活性作为监测指标可以很好的反应卵巢的氧化损伤程度。

ROS参与卵子和胚胎的重要生理活动，当其浓度失控时会损害卵子和胚胎，使受孕失败或胎儿畸形。本研究通过酶联免疫法检测卵巢组织中ROS的含量，来反映细胞组织内氧化应激水平。结果提示姜黄素干预后，血清及卵巢、子宫组织中ROS都有不同程度的下降，说明姜黄素能够抑制ROS的生成，与文献报道[11]的结果一致。研究指出[12]，作为信号分子的内源性ROS在排卵过程中起着非常重要的作用，在外来刺激的作用下，ROS是卵泡细胞及颗粒细胞凋亡的重要起始信号。当ROS增加时，破坏细胞大分子及细胞的部分氧化还原反应，影响由氧化还原反应介导的细胞活动，细胞氧化应激就发生了[13，14]。本实验在血清及卵巢、子宫组织中，姜黄素通过降低ROS浓度，抑制细胞凋亡通路，减少卵泡细胞及颗粒细胞的凋亡，反映在组织形态上表现为皮质增厚、卵泡增多等。然而，随着姜黄素剂量的增加，ROS含量没有随之递减，推测姜黄素降低ROS含量可能存在一个阈值，当达到最低有效浓度时，即使增加浓度其抗氧化能力也不会随之增加。MDA是脂质氧化终产物，会引起生命大分子蛋白质、核酸等的交联聚合，且具有细胞毒性。MDA的高低可以间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度[11]。所以通过检测MDA含量作为间接反应卵巢受ROS损伤的客观评价指标。本研究中，姜黄素干预后，卵巢、子宫组织中MDA明显降低，说明姜黄素能够抑制MDA生成，反映姜黄素干预后小鼠卵巢、子宫组织细胞受ROS损伤的程度降低，姜黄素对氧化产物造成的卵巢、子宫组织损伤有保护作用。

卵巢氧化应激是多种卵巢疾病以及生殖内分泌疾病的基础发病机制，姜黄素可通过降低卵巢组织氧化应激反应来保护由氧化应激造成的组织细胞的损伤，为目前研究女性生殖系统氧化损伤疾病提供一个新选择。但各种疾病有着各自的特点，具体每种疾病对姜黄素治疗后的反应如何，机制是否相同，还有待于以后的研究来证实。

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（收稿日期：2014-07-10）