间隙连接基因Cx32在肝细胞癌中的表达意义

[摘要] 目的：探讨肝细胞癌（HCC）、癌旁组织及正常肝组织中细胞间隙连接Cx32mRNA与Cx32蛋白的表达及其在HCC发生中的意义和机制。方法：应用Western blot和RT-PCR分别检测Cx32蛋白和Cx32mRNA在26例HCC组织、22例癌旁组织和9例正常肝组织中的表达。结果：Cx32蛋白在HCC中的表达明显低于正常肝组织和癌旁肝组织（P＜0.01）；Cx32mRNA在HCC、癌旁肝组织和正常肝组织均有一定水平，但三者之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：Cx32蛋白在肝癌中的表达下调可能是肝癌发生的重要环节，Cx32蛋白的减少与该基因在翻译或蛋白质的加工修饰过程中调控异常有关。

[关键词] 细胞间隙连接通讯；间隙连接蛋白32；肝细胞癌

[中图分类号] RR735.702[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2011）07（b）-022-03

The significance of gap junction gene Cx32 expression in hepatocarcinogenesis

WANG Sai1, HUO Jirong2*, WANG Haiqing2, SHI Xiaoliu2, LIU Deliang2

1.The Central Hospital of Changsha City, Changsha 410004, China; 2.Department of Digestion, the Second Xiangya Hospital of the Central South University, Changsha 410001, China

[Abstract] Objective:To investigate the significance of gap junction protein Cx32 and Cx32mRNA in hepatocarcinogenesis. Methods: Cx32 protein and Cx32mRNA in 26 cases of HCC, 22 case of their related adjacent cancer tissues and 9 cases of normal liver tissue were analyzed by Western blot and RT-PCR. Results: Expression of Cx32 protein in HCC was significantly lower than their related adjacent-cancer tissues and normal liver tissues (P

[Key words] Gap junction intercellar communication; Connexin32; Hepatocellular carcinoma

间隙连接是一类形成于相邻细胞间的连接复合体，Cx32是主要表达在肝脏组织中的间隙连接蛋白。由间隙连接介导的细胞间通讯被称为细胞间隙连接通讯（GJIC），参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联。对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。由各种机制引起的Cx32的改变或毁损将导致细胞增生及分化的失控，进而导致肿瘤的产生。为了解Cx32mRNA及其蛋白产物与肝细胞癌（HCC）发生的关系，该实验应用Western blot、RT-PCR分别检测HCC、癌旁组织和正常肝组织中Cx32蛋白及Cx32mRNA水平，并进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料

26例HCC（肿瘤实质组织）及22例肝癌癌旁标本（距离癌肿3～5 cm以外的肝组织）来源于2008～2010年中南大学湘雅二医院外科手术切除标本，9例正常肝组织标本为2006～2010年该院外科外伤性肝破裂患者的手术切除标本。Cx32鼠抗人单克隆抗体购自美国Zymed公司，β-actin鼠抗人单克隆抗体购自美国Sigma公司，ECL试剂盒购自Pharmacia公司，TRizol购自美国MRC公司，AMV逆转录试剂盒购自美国Promega公司，PCR引物购自上海博亚生物工程公司（Cx32上游引物：5'-CAGCTTGTTGATCTCATTCTGC-3'，下游引物：5'-GCATCATCCTCAATGTGGC-3'，目的片段长度为150 bp；β-actin上游引物：5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'，下游引物：5'-CATCTCTT GCTCGAAG TCCA-3'，目的片段长度为318 bp），Taq酶系统购自大连宝生物工程公司。

1.2方法

1.2.1 标本处理所有标本用预冷的生理盐水冲洗，离体后半小时内置入-196℃的液氮中保存。

1.2.2 Cx32蛋白含量测定用RIPA buffer提取蛋白质，DC protein assay法测定总蛋白含量，取等量蛋白质行SDS-PAGE凝胶电泳。转膜、封闭后，加鼠抗人Cx32单克隆抗体（1∶500），HRP标记的兔抗鼠二抗（1∶10 000），ECL试剂盒检测Cx32蛋白信号。Bandscan5.0软件进行灰度值扫描分析。

1.2.3 Cx32mRNA的测定组织总RNA的提取，逆转录合成cDNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，Bandscan5.0软件进行灰度扫描分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件包进行统计学分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间均数比较用方差分析，有显著差异者再进行两两比较，P

2 结果

2.1 Cx32在HCC中的蛋白表达水平

见图1。由图1可知，Cx32在HCC中的蛋白表达水平下降。各组织间Cx32蛋白Western blot检测产物灰度值比较见表1，由表1可知，经单因素方差分析，各组间差异有统计学意义（P

1.阳性对照：小鼠肝脏；2.阴性对照：小鼠心脏；3.正常肝组织；

4.癌旁组织；5.HCC组织

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图 1 肝癌组织、癌旁组织及正常肝组织的Cx43蛋白Western blot检测

表1 各组间Cx32蛋白Western blot检测产物灰度值比较

注：与正常肝组织比较，P

2.2 Cx32mRNA在HCC组织、癌旁组织及正常肝脏中的表达

见图2、表2。灰度扫描分析提示：各组总体均数方差齐，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。说明HCC中Cx32mRNA水平较癌旁组织以及正常肝组织无明显差别。

1.阴性对照；2.正常肝组织；3.癌旁组织；4.HCC组织；

M:100 bp DNA ladder Marker

图2 Cx32mRNA PT-PCR产物6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

表2 各组间Cx32/β-actin PCR产物灰度值比较

3 讨论

Cx32是主要表达在肝脏组织中间隙连接蛋白。研究表明Cx32与HCC发生的关系有以下几点：①Cx32基因编码缺失，导致肝脏内GJIC减少，促进二乙基亚硝胺的致癌作用[1]；②Cx32基因敲除后使HCC发生率增加[2]；③Cx32蛋白在细胞浆中的分布异常促进HCC的进展[3]。本实验对HCC、癌旁组织和正常肝组织中Cx32蛋白进行检测，发现人类HCC组织中Cx32蛋白表达水平较后两者明显降低，而癌旁组织和正常肝组织中该蛋白无明显差异，提示HCC中Cx32蛋白表达的减少可能是HCC发生的重要机制之一。

HCC中Cx32mRNA水平正常，提示HCC的Cx32蛋白缺失，可能与Cx32基因在翻译，或蛋白质的加工修饰过程异常相关。Cx32基因表达受抑，导致GJIC异常可能与Cx32基因突变、Cx32mRNA表达减少和（或）表达异常、Cx32蛋白磷酸化异常相关。①Cx32基因突变：Cx32基因的突变情况很少见。Krutovskikh等[4]对20例HCC患者进行研究，发现肝组织中无Cx32基因的突变。Omori等[5]在由EHEN诱导产生的大鼠HCC中发现了在220密码子处产生了GA的置换突变，导致了组氨酸代替了精氨酸，但此种错义突变并未损害Cx32形成GJIC的能力。因此，Cx32的基因突变未在HCC的发生中起作用。②Cx32mRNA表达减少和（或）表达异常：由苯巴比妥所致的大鼠HCC中，Cx32mRNA水平明显下降[6]，人类胃癌组织中其表达水平亦下降，并与其细胞成熟状态相关。但也有报道[7]指出，大鼠和人类HCC研究中Cx32mRNA与正常肝组织和癌旁组织相比较未发现差异有统计学意义，本实验结果与之一致。Cx32mRNA表达水平在肿瘤中的这两种截然相反的结果可能与DNA甲基化和细胞特异性转录因子等因素有关。③Cx32蛋白磷酸化异常：在HCC内信号转导研究中，人们发现Cx32蛋白酪氨酸磷酸化作用与GJIC功能的抑制相一致。亦有报道指出表皮生长因子能激活数种细胞系中的MAPK路径，使Cx32蛋白磷酸化而抑制GJIC功能[2]；通过使用MAPK抑制剂（PD98059）抑制MAPK通路可使肝细胞中的GJIC恢复。同时，在缺失Cx32表达的恶性肿瘤中发现MAPK（p44/Erk1，p42/Erk2）和JNK/SAPK/AP1信号表达水平明显增高[8]。此外，Cx32蛋白磷酸化调节也可能与多种蛋白激酶、生长因子受体等多种信号的参与有关。本实验观察到Cx32蛋白在HCC中明显降低，而Cx32mRNA水平无显著改变，提示HCC中Cx32蛋白缺失可能是Cx32基因在翻译或蛋白质的加工修饰过程中异常所致。这些磷酸化调节的异常可能使Cx32蛋白出现装配组合改变，无法形成有效的GJIC。同时，Cx32蛋白降解异常，使GJIC正常功能减弱，肿瘤细胞能逃避机体的免疫监视和生长控制。总之，HCC中Cx32蛋白减少及其磷酸化机制仍有待进一步研究。

[参考文献]

[1]Event M, Ott T, Achim T. Morphology and morphometic investigation of hepatocellular preneoplastic lesions and neoplasms in connexin32-deficient mice [J]. Carcinogenesis,2002,23(5):697-703.

[2]King TJ, Lampe PD. Mice deficient for the gap junction protein Connexin32 exhibit increased radiation-induced tumorigenesis associated with elevated mitogen-activated protein kinase (p44/Erk1, p42/Erk2) activation [J]. Carcinogenesis,2004,25(5):669-680.

[3]Kawasaki Y, Omori Y, Li Q, et al. Cytoplasmic aberration of connexin32 expands cancer stem cell population in human HuH7 hepatoma cells by enhancing its self-renewal [J]. Int J Cancer,2011,128(1):51-62.

[4]Krutovskikh VA, Mazzoleni G, Mironov N, et al. Altered homologous and heterologous gap-junctional intercellular communication in primary human liver tumors associated with aberrant protein localization but not gene mutation of connexin32 [J]. Int J Cancer,1994,56(1):87-94.

[5]Omori Y, Krutovskikh V, Mironov N, et al. Cx32 gene mutation in a chemically induced rat liver tumor [J]. Carcinogenesis,1996,17(9):2077-2080.

[6]Mesnil M, Krutovskikh VA, Mesnil M, et al. Phenobarbital specifically reduces gap junction protein mRNA level in rat liver [J]. MOL Carcinogenesis,2002,1(2):79-81.

[7]Jee H, Nam KT, Kwon HJ, et al. Altered Expression and Localization of Connexin32 in Human and Murine Gastric Carcinogenesis [J]. Dig Dis Sci,2010,56(5):1323-1332.

[8]Lin FL, Chang CI, Chuang KP, et al. Advanced glycation end products down-regulate gap junctions in human hepatoma SKHep cells via the activation of Src-dependent ERK1/2 and JNK/SAPK/AP1 signaling pathways [J]. J Agric Food Chem,2010,58(15):8636-8642.

（收稿日期：2011-04-25）

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