不同龋敏感儿童菌斑中变异链球菌数量及菌群比例的定量分析

[摘要] 目的 比较不同龋敏感儿童口腔菌斑中变异链球菌数量及其在菌群中比例的差异。方法 采集26名3～4岁不同龋敏感的儿童牙面菌斑，运用TaqMan探针实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测有龋组和无龋组儿童菌斑中变异链球菌和总菌数量，以及变异链球菌在总菌群中所占的比例，并对结果进行分析比较。结果 有龋组和无龋组儿童每毫克菌斑中变异链球菌菌落数分别为1.33×105、1.16×103 CFU·mg-1，二者间差异有统计学意义（P=0.033）；每毫克干重菌斑中总菌落数分别为7.17×107、1.01×108 CFU·mg-1，二者间差异无统计学意义（P=0.418）；有龋组和无龋组变异链球菌在总菌中所占比例分别为0.058 6和0.018 6，二者间差异有统计学意义（P=0.008）。结论 无龋与患龋儿童牙面总菌群数量差异无显著性，但患龋儿童牙面菌斑中变异链球菌数量更多，在总菌群中所占比例更大。提示菌斑中变异链球菌与总菌的比例与儿童患龋风险密切相关，可以作为评估龋易感性和预测龋病发展趋势的新指标。

[关键词] 龋齿； 乳牙； 牙菌斑； 变异链球菌； 实时荧光定量聚合酶链反应

[中图分类号] R 781.1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.018

乳牙龋是影响儿童口腔健康的主要疾病之一，变异链球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是与乳牙龋关系最密切的致龋菌之一。林焕彩等[1]研究发现高龋儿童变异链球菌检出率高于无龋儿童，菌斑致龋菌的种类越多，龋活跃性也就越高。支清蕙等[2]通过任意引物聚合酶链反应（arbitrarily primed-polymerase chain reaction，AP-PCR）法验证了上述结果，推断口腔中定植的变异链球菌是乳牙龋高发的危险因素。流行病学调查表明：龋活跃性分布不均，在发达国家学龄儿童中60%～70%龋发生在20%人群[3]。另外美国公共卫生调查也显示：1/4的学龄儿童拥有3/4的龋齿[4]。以往文献[5-6]显示儿童龋病不均衡性与变异链球菌数量密切相关。近期研究[7]表明口腔菌群是个复杂的微生物群落，菌种的多样性和复杂性对龋齿的发生起着更重要的作用，提示变异链球菌在总菌群中的比例能更好地反映龋齿发生是多因素综合作用的结果[8-10]。由此可见，儿童口腔中变异链球菌数量及与菌群比例的定量研究是了解龋齿高危人群和儿童龋病不均衡性的重要途径。

本研究应用TaqMan探针实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法对不同龋敏感儿童菌斑样本进行检测，比较有龋和无龋儿童牙菌斑中变异链球菌数量、总菌量以及变异链球菌在总菌群中所占比例的差异，为从细菌水平上对乳牙龋齿的发生进行预测和预防提供相关依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料、试剂和仪器

变异链球菌标准菌株Ingbritt（c）（首都医科大学微生物教研室提供），TaqMan Universal PCR Master Mix、ABI 7500型定量PCR仪（Applied Biosy-stems公司，美国），溶菌酶、核糖核酸酶A（Merck公司，德国），杆菌肽（Amresco公司，美国），TYC Medium 培养基（Idgplc公司，英国），QIAamp DNA Mini Kit试剂盒（Qiagen公司，德国），Micro-Modulyo冷冻干燥机（Thermo Electron公司，美国），BioNano超微量紫外可见分光光度计（Thermo Scien-tific公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 研究对象 随机抽取北京市海淀区某幼儿园小班学生26名，其中男14名，女12名。年龄3～4岁，平均年龄（3.7±0.3）岁。抽样人群符合以下要求：采样前2周内未服用过抗生素类药物，除龋齿外无其他口腔疾病及系统性疾病病史，采样前2 h禁食，采样期间除儿童日常刷牙外无其他特殊口腔健康措施实施。本研究经北京大学生物医学伦理委员会批准，所有研究对象家长均知情同意。

1.2.2 口腔检查 由1名口腔专业医师担任检查者，在幼儿园现场采集龋病临床数据。龋病检查程序、器械和诊断标准依据WHO口腔健康调查基本方法（3版）。检查者经第三次全国口腔健康流行病学调查技术指导组成员培训，统一龋病检查方法和标准，标准一致性检验Kappa>0.8，项目检查前后检查者自身标准一致性检验Kappa>0.9。1名经培训的护士负责记录数据，1 d内完成儿童口腔龋病检查。记录龋失补牙面数（decayed missing filled surfaces，dmfs）。根据dmfs将受检儿童分为无龋组（dmfs=0）和有龋组（dmfs≥1）。

1.2.3 样本采集及处理 上午9：30-10：30采集菌斑样本，无菌挖匙刮取上颌乳磨牙颊侧完好牙面菌斑，转移至装有100 μL PBS（1×）液的EP管中（空管称重为M0），常温下8 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，重复离心一次后保留沉淀；用真空冷冻干燥机干燥沉淀1～2 h至水分完全挥发，然后称取EP管+干菌斑的重量为M1，并计算出干菌斑重量M2（M2=M1-

M0）。处理完的样本置于-20 ℃冰箱贮存。

1.2.4 变异链球菌标准菌株及细菌基因组DNA提取 向变异链球菌标准菌株梯度稀释后样本、菌斑样本中加入裂解缓冲液，缓冲液包括20 mmol·L-1 Tris·HCl（pH 8.0）、2 mmol·L-1 乙二胺四乙酸（ethylene-diamine tetraacetic acid，EDTA）（pH 8.0）、1.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）。300 W超声破碎，破2 s停1 s，循环30次；100 ℃水浴30 min，冷却至室温；再加入200 g·L-1溶菌酶，振荡混匀后37 ℃恒温水浴过夜。经过预处理后的菌斑样本按照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒操作步骤提取基因组DNA。

1.2.5 DNA浓度测定 使用BioNano超微量紫外可见分光光度计测定10倍倍比稀释的变异链球菌标准菌株和样本总菌DNA浓度和纯度。A260/A280为1.8～2.0，表明纯度合格。根据测得的变异链球菌标准菌株浓度与循环阈值（Ct值）对应关系，计算有龋组和无龋组变异链球菌浓度及其在总菌中所占比例。

1.2.6 引物及探针合成 变异链球菌特异性引物及探针和细菌通用引物及探针的设计参考文献[6，11]。引物和TaqMan探针（5’-FAM，3’-TAMRA）均由北京赛百盛基因技术有限公司合成，具体见表1。

1.2.7 实时荧光定量PCR及产物分析 变异链球菌标准菌株复苏、纯分和增菌后进行10倍倍比稀释，各稀释浓度菌液分别进行菌落培养计数及DNA提取（见1.2.4），绘制标准曲线。将标准菌株和样本DNA在ABI 7500型定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，然后95 ℃ 15 s，变异链球菌和总菌退火延伸温度分别为60 ℃和68 ℃ 1 min，进行40个循环。反应试剂盒为Taq-Man Universal PCR Master Mix；反应体系总体积为20 μL，包括TaqMan Universal PCR Master Mix（2×）10 μL，正反引物（2 μmol·L-1）各2 μL，TaqMan探针（2.5 μmol·L-1）为2 μL，待测DNA模板为1 μL，ddH2O 3 μL。

1.3 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行分析。使用卡方检验比较有龋组和无龋组变异链球菌检出率的差异；使用Wilcoxon秩和检验对有龋组和无龋组变异链球菌数量、总菌数量及变异链球菌占总菌数比例的差异进行分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

2.1.1 变异链球菌标准菌株菌落培养计数 选择菌落数在30～300之间的培养皿计数。稀释倍数为104、105、106的标准菌株液对应的平均菌落数分别为280、27.7、2.7，可见连续3个10倍倍比稀释浓度所对应的菌落数也存在较好的10倍倍数关系。

2.1.2 变异链球菌标准菌株扩增曲线 变异链球菌及阴性对照荧光定量PCR扩增曲线见图1。

2.1.3 绘制标准曲线 在10～105稀释倍数范围内，变异链球菌标准菌株Ct值与起始菌落数对数之间呈良好的线性关系（R2=0.988 2，斜率K=-0.244，截距B=9.950 3），证实了用Ct值进行菌落定量的准确性（图2）。

2.2 菌斑样本实时荧光定量PCR结果

2.2.1 基本情况 本实验26名儿童中患龋16人，无龋10人。两组间性别比例和年龄分布的差异均无统计学意义（P>0.05）。

26份菌斑样本中，有龋组和无龋组菌斑重量分别为（1.3±0.8）、（1.6±1.2） mg，二者间差异无统计学意义（P=0.370）；有龋组和无龋组总菌DNA浓度分别为（94.51±41.32）、（90.13±37.92） ng·μL-1，

二者间差异无统计学意义（P=0.789）。

2.2.2 菌斑样本实时荧光定量PCR结果 应用实时荧光定量PCR分别检测26份菌斑样本变异链球菌和总菌数量，有龋组和无龋组变异链球菌检出率分别为93.8%和70.0%，差异无统计学意义（P=0.264）；每毫克干重菌斑中变异链球菌菌落数分别为1.33×105、1.16×103 CFU·mg-1，二者间差异有统计学意义（P=

0.033）；每毫克干重菌斑中总菌落数分别为7.17×107、1.01×108 CFU·mg-1，二者间差异无统计学意义（P=

0.418）；有龋组和无龋组变异链球菌在总菌中所占比例分别为0.058 6和0.018 6，二者间差异有统计学意义（P=0.008）。

3 讨论

唾液中变异链球菌的数量可作为龋活跃性评估以及龋病状态检测的指标[5，8，12-13]。变异链球菌存在于直接黏附在牙面上的菌斑中，用菌斑中变异链球菌水平对患龋风险进行评估更为直接和准确[14]。牙冠不同部位菌斑微生物组成不同，龋坏区域内的变异链球菌数目明显增多，尤其在龋表层的变异链球菌的比例最高[15]。为了避免龋坏组织对菌斑中变异链球菌检出数量的影响，本研究选择从双侧上颌乳磨牙颊侧完好牙面采集菌斑。另外，以往研究通过菌斑湿重来衡量单位重量菌斑中变异链球菌数量的方法存在弊端，比如描述菌斑重量时使用约数不准确，菌斑中水分含量对结果的影响等。为了减少这方面误差，本研究对菌斑样本进行了真空干燥处理，排除了水分重量影响，检测结果以每毫克干重菌斑中细菌量来表示，减少液体干扰因素。

本研究结果表明：1）有龋组和无龋组儿童菌斑中变异链球菌检出率差异无统计学意义，与其他研究[8，16]结果相似，说明变异链球菌是人口腔条件致病微生物，其存在并不是龋发生的必然因素。Choi等[9]通过实时定量PCR检测发现无龋儿童菌斑中变异链球菌检出率为80%，有龋儿童变异链球菌检出率则为100%，本研究中变异链球菌检出率在数值上略低于Choi等[9]的报道，分析原因可能为Choi等[9]研究的样本人群年龄较本研究偏大（5～6岁），推测变异链球菌在学龄前组人群口腔内定植或口腔内变异链球菌数量多于幼儿组人群，导致检出率增高。2）有龋组和无龋组每毫克干重菌斑中变异链球菌菌落数有显著性差异（P=0.033）。Yoshida等[6]通过TaqMan荧光定量PCR检测菌斑样本中变异链球菌数量为0～4.82×106 CFU·mg-1（湿重菌斑），略高于本研究。Yoshida等[6]的研究中未记录样本人群口腔dmfs状况。Choi等[9]的研究表明龋均大的个体，菌斑中变异链球菌计数高，在总菌中比例高。3）有龋组和无龋组每毫克干重菌斑中总菌落数、菌群DNA浓度差异无统计学意义，推测有龋和无龋儿童菌斑中总细菌数量差别不大，但由于菌种构成比例不同，菌种间存在互相拮抗抑制或者协同促进，从而对龋活跃性产生不同的影响。4）近年来有学者开始研究各菌群间比例与患龋风险之间的关系，而不仅是关注致龋菌的绝对数量。Hata等[10]研究发现3～4岁儿童菌斑中变异链球菌与总菌的比例为0.01～0.058，并提出龋病的发生与变异链球菌在总菌中所占比例密切相关。Yoshida等[6]研究结果表明变异链球菌在总菌中所占比例为0～0.072。本研究中有龋组和无龋组变异链球菌在总菌中所占比例分别为0.058 6和0.018 6，与上述两研究结果基本相近。并且二者间差异有统计学意义（P=0.008），说明至少在本组人群中变异链球菌与总菌的比例比变异链球菌检出率能更好地反映龋的活跃性，对龋齿易感人群的评估、龋病的预防和早期干预有较高的应用价值。

本研究结果表明，TaqMan探针荧光定量PCR能高效、灵敏、准确地检测变异链球菌和总菌数量；不同龋敏感儿童菌斑中变异链球菌及其与总菌的比例存在差异；变异链球菌在总菌群中所占比例与患龋风险密切相关，在评估龋易感性方面有重要意义。

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