RNAi沉默Plk1对胰腺癌细胞系AsPC—1侵袭转移的影响

[摘要] 目的 探讨RNAi沉默Plk1基因表达与胰腺癌细胞侵袭转移能力的关系。 方法 根据Plk1基因特点，设计并用化学方法合成了4个小干扰核糖核酸分子（siRNA）（shplk1-1、shplk1-2、shplk1-3、shplk1-4），脂质体转染法将短链siRNA转入AsPC-1细胞；细胞分为：未处理组为对照组、空质粒组、shplk1-1组、shplk1-2组、shplk1-3组、shplk1-4组。采用RT-PCR和Western blot法检测siRNA对Plk1表达的抑制效果；采用Transwell法检测转染后细胞侵袭能力；采用划痕实验检测转然后细胞迁移能力。 结果 RT-PCR和Western blot结果示所设计的4个siRNA均能明显抑制AsPC-1细胞Plk1 mRNA水平，以shplk1-3效果最好，与对照组、空质粒组及其他三组比较，转染shplk1-3组Plk1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低（P < 0.01）；以转染shplk1-3处理AsPC-1细胞后与对照组、空质粒组比较，Transwell侵袭实验证实：细胞转染24 h后，正常对照组、空质粒组和shplk1-3组穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为（195±16）、（176±13）、（83±5）个，侵袭能力明显降低，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；细胞划痕实验证实：shplk1-3组迁移能力明显降低。 结论 抑制胰腺癌细胞Plk1基因，侵袭迁移能力明显降低，能够为胰腺癌的治疗提供新的策略。

[关键词] Plk1；RNAi；胰腺癌；侵袭；转移

[中图分类号] R735.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（b）-0004-04

胰腺癌是一种恶性程度高、进展迅速、手术切除率低、预后极差的恶性肿瘤，术后5年生存率为3%～8%[1]。究其原因主要是因为胰腺癌发现时已经处于局部中晚期，存在胰周临近许多重要器官的直接浸润和转移，如何进一步寻找更加有效的治疗手段和方法，抑制胰腺癌的侵袭和转移对于提高胰腺癌的治疗效果和预防复发有着重要的作用和意义[2]。人类Plk1基因于1994年由GoIsteyn等[3]最先克隆报道，定位于16p12.3，mRNA长约2.2 kb，编码的蛋白质分子量约为67 kd。本研究以Plk1为靶基因，采用RNAi技术沉默Plk1基因表达，观察其与胰腺癌细胞侵袭转移能力的关系及对细胞凋亡的影响，以期为胰腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

鼠抗人Plk1单克隆抗体（美国Zymed公司），兔抗人Plk1多克隆抗体（美国Calbiochem公司），PCR引物和shplk1-1、shplk1-2、shplk1-3、shplk1-4由上海钰森生生物试剂公司合成；小牛血清，RPMI 1640培养基（Gibco公司），RNA酶A（RNaseA）（Sigma公司），Trizol（MRC公司），总RNA提取试剂盒（美国Promega公司），反转录试剂盒Reverse Transcription System（美国Promega公司），Rneasy Mini Kit（美国QIAGEN公司），DL2000 DNA Marker，RT-PCR试剂盒TaKaRa Taq（日本TaKaRa公司），孔板，24孔板（Costar公司），琼脂糖（美国Merck公司），细胞裂解用蛋白酶抑制剂混合片（Roche公司），化学发光检测试剂盒（安玛西亚公司），Matrigel胶购自美国BD公司，Transwell小室系统购自美国Coster公司，产品其他常用试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养及转染

胰腺癌细胞株AsPC-1购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库，细胞分别置于含10%小牛血清，抗生素（含100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素）和2 mmol/L谷胺酰胺的RPMI 1640培养液中，在37℃、%CO2、湿度为95%的恒温培养箱中培养，每隔2～3 d传代1次。实验选用对数生长期的细胞，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）混合消化液消化，用含10%的小牛血清RPMI-1640培养液稀释成单细胞悬液（106/mL）以4000细胞/孔接种于6 cm培养皿中进行实验，将实验分为对照组（未处理组）、空质粒组、shplk1-1组、shplk1-2组、shplk1-3组、shplk1-4组，应用Invitrogen公司转染试剂盒按说明书进行转染，培养48 h后提取总Plk1 RNA和蛋白。

1.3 RT-PCR检测目的基因Plk1 mRNA的表达

用Rneasy Mini Kit试剂盒提取各实验组细胞总RNA，按照Promega公司的反转录试剂盒操作手册进行反转录。Plk1引物序列：上游引物5'-AAGAGATCCCGGAGGTCCTA-3'；下游引物5'-TCATTCAGGAAA AGGTTGCC-3'产物长度450 bp。扩增条件：预变性94℃ 5 min，94℃ 30 s，63℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。以β-actin为内参，引物序列：上游引物5'-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3'；下游引物5'-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3'产物长度219 bp。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上分离，通过Bio-Rad公司凝胶分析软件分析条带光密度。

1.4 Western blot检测目的基因Plk1蛋白的表达

收集“1.3项”下同期处理的细胞提取蛋白。细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后加入150 μL细胞裂解液（50 mmol/L Tris-Cl，150 mmol/L NaCl，0.02%叠氮钠，0.1%SDS，100 μg/mL苯甲基磺酰氟，1 μg/mL Aprotinin，1% Nonidet P-40，0.5%去氧胆酸钠），冰上静置20 min。用细胞刮匙将细胞从培养皿中刮落，收集于Ep管中，置冰上超声细胞粉碎仪超声处理20 s。12 000 r/min，4℃离心15 min，收集上清，用Bio-Rad公司的DC Protein Assay试剂盒进行蛋白定量。以总蛋白量20 μg/孔进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳完毕，将凝胶上的蛋白用湿转移法转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。膜用含5%脱脂牛奶的TBS室温封闭1 h，TBS洗3遍，加以封闭液稀释的抗Plk1抗体（1∶200）和抗β-actin抗体（1∶500），4℃过夜，TBS洗3遍，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗孵育（1∶3000）1 h，ECL化学发光，暗室曝光显影，计算机分析。

1.5 Transwell肿瘤细胞侵袭实验

将放于4℃过夜融化的Matrigel胶用无血清培养基按比例为1∶3稀释配成胶，将小室放在24孔板内，每个小室加入80 μL稀释好的Matrigel胶，分3次铺，每次间隔10 min，每次铺完胶后在37℃下干燥；最后一次干燥10 min后，在上层小室内分别加入4组细胞（未处理组、空质粒组、shplk1-3组和对照组）各100 μL（浓度为1×106/mL）个。下层小室各加入10%的FBS，于37℃，5%CO2条件下培养72 h；每组细胞设3个复孔，实验重复3次，弃去上室中的培养液，并擦去Matrigel胶，滤膜冰甲醇固定1 min后行苏木精-伊红染色（HE），棉棒轻轻擦去滤膜顶层的细胞，进行侵袭实验结果观察：各选择5个无重叠区，于高倍镜（200×）下摄片，同时分别计数24孔板中的细胞数，结果以均值表示。

1.6 细胞迁移实验

取传代48 h长势良好的两组细胞（空质粒组和shplk1-3组）制备单细胞悬液，按1×105个细胞（500 μL）/孔将细胞加入6孔板，5%CO2培养箱内于37℃孵育培养。采用划痕法用消毒过的枪头在80%汇合的单层细胞表面划出一无细胞的细痕，用PBS漂洗3次以除去划下的细胞，加入新鲜无血清培养液继续培养观察12、24 h，在倒置显微镜下观察拍照。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 12.0对数据进行分析，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测各组细胞Plk1 mRNA的含量

以β-actin作为内对照，比较Plk1的条带差异明显，对照组、空质粒组、shplk1-1组、shplk1-2组、shplk1-3组、shplk1-4组的Plk1 mRNA相对量分别为（2.38±0.19）、（2.14±0.16）、（1.96±0.14）、（1.82±0.17）、（1.22±0.12）、（1.56±0.15），shplk1转染各组Plk1 mRNA的表达低于对照组和空质粒组，其中以shplk1-3组Plk1 mRNA相对量最低，与各组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图1。

1：Marker；2：对照组；3：空质粒组；4：shplk1-1组；5：shplk1-2组；6：shplk1-3组；7：shplk1-4组。shplk1-1组、 shplk1-2组、shplk1-3组、shplk1-4组条带与对照组、空质粒组及Marker比较，plk1 mRNA的表达受到明显干预，其中尤以shplk1-3组干预最为明显（P < 0.01）

图1 RT-PCR检测各组细胞Plk1 mRNA含量比较

2.2 Western blot法测定Plk1蛋白的表达

以β-actin为内参，可见68 kd左右的蛋白带，它与Plk1抗体特异性结合，证明为Plk1表达的蛋白，对照组、空质粒组、shplk1-1组、shplk1-2组、shplk1-3组、shplk1-4组的Plk1相对量分别为（1.243±0.143）、（1.122±0.121）、（0.953±0.018）、（0.775±0.020）、（0.275±0.154）、（0.543±0.125），shplk1转染各组Plk1蛋白相对量相对较低，其中以shplk1-3转染组显著低于其它各组（P < 0.01）。见图2。

1：DL2000marker；2：对照组；3：空质粒组；4：shplk1-1组；5：shplk1-2组；6：shplk1-3组；7：shplk1-4组

图2 Western blot检测各组细胞 Plk1蛋白表达比较

2.3.Transwell侵袭实验

对照组、空质粒组、shplk1-3组穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为（195±16）、（176±13）、（83±5）个（图3）。结果显示，稳定转染后的shplk1-3组穿过Matrigel胶的侵袭细胞数较空质粒组和对照组明显减少（图4），方差分析显示差异有高度统计学意义（P < 0.01）；而其余两组组间差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.4 细胞迁移实验

在两组细胞内划出相同宽度的痕迹后，空质粒组比shplk1-3组细胞迁移速度快，12 h后，空质粒组已侵入近1/2距离，而shplk1-3组仅侵入1/3左右，24 h后空质粒组已经基本融合，而shplk1-3组仅侵入1/2左右（图5）。结果表明，shplk1组细胞迁移能力明显低于对照组。

图5 两组细胞在0、12、24 h的迁移图

3 讨论

胰腺癌是一种恶性度很高的肿瘤，临床上虽然采取了手术、化疗、放疗等多种治疗方法，但疗效却不十分理想，重要原因是胰腺癌发现时已经处于局部浸袭和转移，进一步研究和探讨胰腺癌侵袭转移的作用机制仍然是胰腺癌治疗研究领域的难点和热点[4]。RNAi技术在肿瘤上的研究已经取得较大进展，目前大多数学者通过RNAi沉默癌基因、促进肿瘤细胞的凋亡、调控细胞周期、对肿瘤新生血管的干预以及对参与肿瘤放化疗过程中与耐药相关的特定基因的干预来研究肿瘤定基因的功能与探索相关的治疗手段[5]。多项研究表明，Plk-1在胰腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、食管癌甲状腺癌、鼻咽癌、子宫颈癌、肝转移癌及前列腺癌组织中过表达，其过表达与肿瘤组织分级、恶性程度及预后密切相关[6-11]。Plk-1是一种存在于哺乳动物细胞中的丝/苏氨酸蛋白激酶，通过参与调控细胞周期G2/M期检测点的功能对细胞周期的运行发挥重要作用，Plk-1对控制细胞基因组的稳定性和染色体分配能有效抑制肿瘤细胞增殖与分裂，Plk1已被作为重要的分子药物治疗靶点[12-14]。笔者前期研究已经发现，中心体Plk1在胰腺癌组织细胞中的高表达与其多药耐药机制密切相关，用RNAi技术降低Plk1的表达增强胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性[5，15]。但是通过下调Plk1的表达能否抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移能力目前没有报道，因此本研究采用RNAi干预Plk1的表达，研究靶向抑制Plk1治疗胰腺癌的可行性，为胰腺癌的治疗寻找一种新方法[16]。在本试验中，采用针对Plk1的RNAi来干预Plk1的表达，通过检测转染shplk1的胰腺癌细胞，来进行Plk1 mRNA、Plk1蛋白质表达的检测，发现在转染shplk1-3的AsPC-1细胞中Plk1mRNA和蛋白质水平明显低于未处理组、空质粒组和对照组，表明构建的shplk1-3能够明显的抑制Plk1的表达；同时对该株细胞进行了细胞迁移和侵袭实验，发现与空质粒组、未转染组以及对照组相比，转染shplk1-3的AsPC-1，生长明显变慢、活性降低、侵袭能力减弱，显示出其对胰腺癌细胞良好的干预作用。从而进一步证明Plk1可以作为胰腺癌治疗的一个良好靶点，提示对Plk1的干扰可能是一个有深远前景的治疗肿瘤的策略。

[参考文献]

[1] 张太平，杜潇，赵玉沛.多学科综合治疗胰腺癌现状及评价[J].中国实用外科杂志，2009（9）：771-773.

[2] Cao H，LE D，Yang LX. Current status in chemotherapy for advanced pancreatic adenocarcinoma [J]. Anticancer Res，2013， 33（5）：1785-1791.

[3] Golsteyn RM，Schultz SJ，Bartek J，et al. Cell cycle analysis and chromosomal localization of human Plk1，a putative homologue of the mitotic kinases Drosophila polo and Saccharomyces cerevisiae Cdc5 [J]. J Cell Sci，1994，107（Pt 6）：1509-1517

[4] Ansari D，Tingstedt B，Andersson R. Pancreatic cancer-cost for overtreatment with gemcitabine [J]. Acta Oncol，2013，52（6）：1146-1151.

[5] Yu C，Zhang X，Sun G，et al. RNA interference-mediated silencing of the polo-like kinase 1 gene enhances chemosensitivity to gemcitabine in pancreatic adenocarcinoma cells [J]. J Cell Mol Med，2008，12（6A）：2334-2349.

[6] Zhou Q，Su Y，Bai M. Effect of antisense RNA targeting Polo-like kinase 1 on cell growth in A549 lung cancer cells [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2008，28（1）：22-26.

[7] Feng YB，Lin DC，Shi ZZ，et al. Overexpression of PLK1 is associated with poor survival by inhibiting apoptosis via enhancement of survivin level in esophageal squamous cell carcinoma [J]. Int J Cancer，2009，124（3）：578-588.

[8] Steinhauser I，Langer K，Strebhardt K，et al. Uptake of plasmid-loaded nanoparticles in breast cancer cells and effect on Plk1 expression [J]. J Drug Target，2009，17（8）：627-637.

[9] Rodel F，Keppner S，Capalbo G，et al. Polo-like kinase 1 as predictive marker and therapeutic target for radiotherapy in rectal cancer [J]. Am J Pathol，2010，177（2）：918-929.

[10] Jimeno A，Rubio-Viqueira B，Rajeshkumar NV，et al. A fine-needle aspirate-based vulnerability assay identifies polo-like kinase 1 as a mediator of gemcitabine resistance in pancreatic cancer [J]. Mol Cancer Ther，2010，9（2）：311-318.

[11] Shi W，Alajez NM，Bastianutto C，et al. Significance of Plk1 regulation by miR-100 in human nasopharyngeal cancer [J]. Int J Cancer，2010，126（9）：2036-2048.

[12] Jiang L，Huang Y，Deng M，et al. Polo-like kinase 1 inhibits the activity of positive transcription elongation factor of RNA Pol Ⅱ b（P-TEFb）[J]. PLoS One，2013，8（8）：e72289.

[13] Chopra P，Sethi G，Dastidar SG，et al. Polo-like kinase inhibitors：an emerging opportunity for cancer therapeutics [J]. Expert Opin Investig Drugs，2010，19（1）：27-43.

[14] Schmit TL，Ledesma MC，Ahmad N. Modulating polo-like kinase 1 as a means for cancer chemoprevention [J]. Pharm Res，2010，27（6）：989-998.

[15] Zhang Y，Liu Y，Yang YX，et al. The expression of PLK-1 in cervical carcinoma：a possible target for enhancing chemo sensitivity [J]. J Exp Clin Cancer Res，2009，28：130.

[16] Peng A，Wang L，Fisher LA. Greatwall and Polo-like kinase 1 coordinate to promote checkpoint recovery [J]. J Biol Chem，2011，286（33）：28996-29004.

（收稿日期：2013-11-27 本文编辑：李继翔）