RNAi干扰HMGB1基因对乳腺癌细胞MCF—7增殖的影响

[摘要] 目的 探讨高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）siRNA干扰后对乳腺癌细胞MCF—7增殖的影响。 方法 构建靶向HMGB1 mRNA的质粒载体pRI—GFP—1、pRI—GFP—2以及阴性对照载体pRI—GFP—Neg，分别转染乳腺癌细胞MCF—7，48 h、72 h后免疫印迹法（Western blot）检测HMGB1基因蛋白表达，噻唑蓝（MTT）比色法检测体外增殖活性。 结果 转染后，与空质粒组pRI—GFP—Neg相比，pRI—GFP—1组、pRI—GFP—2组MCF—7细胞HMGB1蛋白表达下降，MTT显示干扰组细胞增殖速率与质粒对照及空白对照组相比显著降低。 结论 应用RNAi技术可以显著干扰HMGB1蛋白的表达，进而有效抑制MCF—7细胞的增殖活性。

[关键词] 高迁移率族蛋白1；RNA干扰；MCF—7细胞

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673—9701（2012）24—0023—03

Effects of HMGB1 silence by RNA interference on the cell proliferation in MCF—7 cells

LAI Lei1 YANG Linjun2 ZHAI Changlin1

1.Department of Oncology，the First People''s Hospital of Tongxiang City in Zhejiang Province，Tongxiang 314500，China；2.Department of Oncology，Changhai Hospital of Shanghai，Shanghai 200433，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of HMGB1 RNA interference on MCF—7 cell proliferation. Methods The plasmid construct pRI—GFP—1， pRI—GFP—2 targeted HMGB1 mRNA and negative control construct pRI—GFP—Neg， were transfected into MCF—7 cells. After 48 h， 72 h， using real—time quantitative PCR to detect HMGB1 gene mRNA expression， WB to detect HMGB1 protein expression；the cell proliferating activity in vitro was examined by MTT analysis. Results After transfection， compared with the pRI—GFP—Neg group， the inhibition rates of HMGB1 expression in MCF—7 cells in pRI—GFP—1 group， pRI—GFP—2 group were decreased. The cell proliferation rate was significantly lower in pRI—GFP—1 group than in pRI—GFP—Neg group （P < 0.05）. Conclusion Application of RNAi technology can significantly interfere the HMGB1 gene expression， thus inhibit MCF—7 cell proliferation.

[Key words] HMGB1； Small interfering RNA； MCF—7 cell

高迁移率族蛋白1（HMGB1）在多种肿瘤中高表达，其水平远高于相对应的正常组织，且与肿瘤的发生发展、病灶大小、浸润及淋巴结转移相关。其机制可能与HMGB1本身作为一种细胞因子能够诱导小血管再生以及可以调控其他一些基因的表达相关。有研究表明HMGB1在乳腺癌组织中的表达与肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结转移及远处转移显著相关，但是缺乏细胞学研究的报道。本研究应用RNA干扰技术构建了HMGB1基因siRNA真核表达载体，观察其对人乳腺癌MCF—7 HMGB1基因表达及细胞生长等生物学功能的影响，旨在进一步阐明HMGB1在乳腺癌中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株和质粒

HMGB1 pRI—GFP质粒及阴性、阳性对照质粒由Inovogen公司构建，人乳腺癌MCF—7细胞株由浙江大学医学院妇产科医院中心试验室提供。

1.2 主要试剂

鼠抗人HMGB1单克隆抗体（德国R&D公司），鼠抗人β—actin多克隆抗体、HRP标记羊抗鼠IgG（H+L）（Pierce Biotechnology， Rock—ford，IL），转染试剂Lipofectin 2000（Invitrogen 公司），实时定量PCR 试剂盒（大连宝生物公司）、RMPI 1640培养液、胎牛血清、无血清无抗生素RMPI 1640培养液。引物由上海生工公司合成。

1.3 MCF—7细胞HMGB1

siRNA 转染MCF—7细胞用含10%小牛血清和抗生素的RMPI 1640培养液，在37℃、5%CO2培养箱中常规培养，细胞呈贴壁生长。实验设四组，实验组pRI—GFP—1、pRI—GFP—2 组、pRI—GFP—Neg（阴性对照）组及空白对照（MCF—7未转染）组。细胞3×105/孔分别接种6 孔板至细胞长满85%～90%后进行转染，具体操作按照试剂说明进行。

1.4 Western blot检测HMGB1蛋白表达

收集各组细胞，定量后取总蛋白40 μg，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经转膜、封闭，加HMGB1 单克隆抗体（稀释度1∶500）辣根过氧化酶标记二抗（Pierce Biotechnology，美国）化学发光试剂增强反应，X光片曝光显影，经ABB成像分析系统扫描（ABI公司，美国），以目的蛋白灰度值与内参β—actin灰度值的比值反映HMGB1的表达水平。

1.5 MTT检测细胞增殖

选择干扰效率较高的pRI—GFP—1组，细胞转染0 h、48 h、72 h后，以每孔1 000个分别接种各组细胞于96孔细胞培养板，同时设立空白对照组，培养24 h后，每孔加20 μL的MTT溶液，37℃，5%CO2饱和湿度下孵育4 h，吸出孔内培养液，每孔加二甲基亚岚（DMSO）150 μL，酶标仪检测每孔吸光度值（A）。

1.6 统计学分析

采用SPSS 15.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用t检验，P < 0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 WB检测各组中HMGB1蛋白的表达

转染48 h、72 h pRI—GFP—1组、pRI—GFP—2组HMGB1蛋白水平较pRI—GFP—Neg组及空白对照组明显减低（P < 0.05）， 且pRI—GFP—1组干扰效率优于pRI—GFP—2组；pRI—GFP —Neg组与空白对照组各时间点蛋白表达差异比较无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 MTT法检测细胞的增殖

转染后48 h、72 h、96 h、120 h pRI—GFP—1组较pRI—GFP—Neg及细胞对照组生长明显受到抑制，差异有统计学意义（P < 0.05），转染后96 h细胞生长抑制率达到最高。

3 讨论

HMGB1是与染色体结合的非组蛋白成分之一。该蛋白基因定位于人染色体13q12 带，共含有5 个外显子，相对分子质量为25 000，由215 个氨基酸组成，属于HMG 蛋白超家族。HMGB1与DNA结合，可稳定核小体形状，作为基因和组织特异性的转录调控因子有调节转录活性的作用。近来的研究表明，多种肿瘤和未成熟细胞均可以产生高迁移率族蛋白HMGB1，与癌细胞侵袭和转移密切相关。

杨晓文等研究表明，HMGB1在乳腺癌组织中的表达与肿瘤临床分期、病理分级、淋巴结转移及远处转移显著相关，但在细胞学的研究未见报道。前期实验已经验证了HMGB1在乳腺癌细胞系中是高表达的，本实验构建了含有U6启动子的HMGB1 siRNA质粒表达载体并转染入乳腺癌细胞系MCF—7中，RT—PCR及WB验证针对两个不同靶位点的两条siRNA干扰效率均达到60%，但是pRI—GFP—1的干扰效率要高于pRI—GFP—2，因此我们在生物学功能实验中选择pRI—GFP—1干扰质粒。研究结果表明，RNA干扰下调HMGB1基因后，MCF—7细胞增殖受到明显抑制，细胞生长曲线低平，缺乏指数增长特征。

HMGB1的生物学活性主要通过与其相应受体的相互作用而实现，其中RAGE是HMGB1的主要受体，通过与HMGB1高亲和力结合，通过激活p38 MAPK，p44/p42 MAPK，SAPK/JNK等信号通路促进细胞生长[6]。有研究显示HMGB1可以抑制p53抑癌活性，阻止细胞对损伤DNA的修复，过度活化Ras/ERK信号传导通路等，抑制HMGB1的表达可能通过以上受体依赖型途径减慢了细胞生长。HMGB1靶向siRNA抑制细胞增殖的具体分子机制还需进一步证实。

[参考文献]

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（收稿日期：2012—04—01）