胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析

李　杨

[摘要]目的：筛选胎兔皮肤组织无瘢痕愈合相关蛋白，并初步分析其在无瘢痕愈合过程中的作用。方法：建立胎兔背部切割伤模型，运用蛋白质组双向电泳技术筛选胎兔皮肤伤后差异表达的蛋白质，并进行质谱和数据库检索分析。结果：筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织异高表达的蛋白质点，经过质谱和数据库检索分析后确定：伴侣素或线粒体蛋白P1前体、弹性蛋白(Vi－mentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖白H(异质性胞核核糖白H)、α烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)等无瘢痕愈合相关蛋白在胎兔皮肤伤后表达增加。结论：上述无瘢痕愈合相关蛋白可能通过对基因转录和翻译的调控，促进胶原蛋白等的合成和正确的折叠、装配，以及促进细胞的增殖、分化和发育等，促进胎兔皮肤创伤的修复，参与其无瘢痕愈合过程。

[关键词]胎兔；皮肤；无瘢痕愈合；创伤：蛋白质组；基质辅助的激光解析电离／飞行时间质谱

[中图分类号]R641　Q591．2　R751　[文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)01―0011－04

自Burrington首次发现胎儿皮肤创伤后修复无瘢痕形成，并确立了“无瘢痕愈合”(Scarless Healing、Scar-free Healing)的概念以来，“无瘢痕愈合”模式成为人们孜孜以求的理想，但至今胚胎个体“无瘢痕愈合”的具体机制还不清楚。我们在前期的研究中发现在胎兔皮肤创伤无瘢痕愈合过程中确有基因表达的差异存在，且差异表达基因可能在其过程中具有重要的作用。而基因最终是通过蛋白质的表达才发挥其功能，本实验运用双向电泳技术，筛选胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白，并进行初步分析。

1　材料和方法

1．1动物与试剂：健康雌性大耳白兔20只，体重(3．0～3．5)kg(第三军医大学大坪医院动物中心)，“速眠新”合剂(长春农牧大学兽医研究所)，哺乳动物总蛋白提取试剂盒(Merck公司)，pH4-7、11cm固相pH梯度(Immoblilized pH gradient，IPG)预制胶条(Bio-Rad公司)，银染增强型试剂盒(Bio-Rad公司)。

1．2动物致伤与分组：对20只妊娠20天的雌兔进行麻醉后，无菌条件下对胎兔背部致切割伤，伤后继续饲养。以20只致伤胎兔作为创伤(Fetal trauma，FT)组，20只同胎未致伤胎兔作为对照组(Fetal control，FC)，20只妊娠兔作为成年创伤对照(Adult trauma control，A7C)组。于伤后24h分别取各组兔伤口处皮肤组织。

1．3总蛋白质提取：用哺乳动物总蛋白提取试剂盒提取兔皮肤组织的总蛋白，并用Bradford法测定其浓度。

1．4胎兔皮肤蛋白质组双向电泳：采用pH值范围4～7、长11cm的IPG胶条进行双向电泳。被动水化；第一向等电聚焦：电压8000V，总聚焦60000Vh：第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)：分离胶采用10％的丙烯酰胺凝胶，分离胶电流30mA／gel，电泳凝胶用硝酸银染色的方法进行染色。

1．5差异蛋白质点选取及初步分析：相同条件下分别对FT、FC、ATC三组兔皮肤总蛋白进行三次双向电泳。凝胶图谱用ImageMaster 2D Platinum图像分析软件分别进行分析，并对三组样品电泳凝胶进行差异比较分析。

对F7组特异高表达差异蛋白质点进行基质辅助的激光解析电离／飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrogram，MALDI-TOF-MS)分析，得到各蛋白点的肽指纹图谱，然后将肽指纹图谱进行数据库检索，分析其功能。

2　结果

2．1动物模型：成年雌兔均健康存活；致伤胎兔死亡4只，存活16只，手术成功率80％；对照胎兔均成活。

2．2皮肤组织总蛋白质：各组样品组织总蛋白浓度分别为：F7组(3．22～4．44)μg/μl、FC组(3．12～4．62)μg/μl、ATC组(16．54～18．96)μg/μl，各组样品总蛋白量分别为：FT组(3886～4664)μg、FC组(3880~4862)μg、ATC组(12432～14226)μg。

2．3总蛋白质双向电泳及无瘢痕愈合相关蛋白的筛选：胎兔致伤组3张电泳图谱上分别检测到91个、107个和117个蛋白质斑点，平均蛋白质点(105±14)个；胎兔对照组分别检测到89个、107个和127个蛋白质斑点，平均蛋白质点(108+19)个；成年创伤对照组分别检测到49个、62个和89个，平均蛋白质点(67±22)个。

选取FT组、FC组、ATC组各自三次电泳图谱中蛋白质点分离较好，数量居中的凝胶作为参考胶，见图1。将胎兔致伤组的参考胶图谱分别与胎兔对照组和成年创伤对照组的参考胶图谱进行比对分析，寻找致伤胎兔表达的差异蛋白质点，即无瘢痕愈合相关蛋白质。本实验得到致伤后胎兔皮肤差异表达的蛋白质点20个，主要分布在(4．3～6．62)kDa之间(见图2)。

2．4　无瘢痕愈合相关蛋白分析：筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织异高表达的蛋白质点，经过质谱、同源性分析和相似性检索后，确定其中有意义的蛋白质为：伴侣素或线粒体蛋白P．前体、弹性蛋白(Vimentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖白H(异质性胞核核糖白H)、α－烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)。

3　讨论

哺乳动物胚胎无瘢痕愈合的机制至今不清，研究显示，胎儿具有的无瘢痕愈合的能力可能与其在胚胎期对炎症的低反应性、效应细胞――纤维母细胞的数量和功能、细胞外基质的成分和含量以及同源异性盒基因(PRX-2和HOXB13)的表达差异等有关，而与胎儿的特殊生长环境无明显关系。我们前期实验从遗传学物质基础出发即寻找基因的差异表达，用改良的SSH筛选出与胎兔皮肤伤后无瘢痕愈合相关的基因片段42个，也提示在胎兔创伤无瘢痕愈合过程中确有基因表达的差异存在。

通过在相同条件下比较具有表型差异的不同样品之间蛋白质表达的异同，寻找与生理／病理现象相关的差异蛋白质，即有可能揭开某些生理／病理现象的机制，并提供可以对其进行人为干预的靶点。基于以上思路，我们在相同条件下同步进行双向电泳，比较分析电泳凝胶，寻找切割伤后胎兔皮肤组织的蛋白质组与对照未致伤胎兔和对照致伤成年兔皮肤组织的蛋白质组表达的差异，从而找出胎兔皮肤伤后无瘢痕愈合相关蛋白质，对其进行初

步的鉴定和分析，了解其在胎兔无瘢痕愈合中的作用，为人为的干预和治疗瘢痕增生过度或增生不良提供理论基础。

3．1　伴侣素／线粒体蛋白P1前体：分子伴侣是一类在细胞内能够协助其他多肽进行折叠、组装、转运、降解的蛋白，并在DNA的复制、转录、细胞骨架功能、细胞内的信号转导等领域发挥着重要的生理作用。分子伴侣分为许多不同的家族，如Hsp100，Hsp90，Hsp70，伴侣素(Hsp60)，DaJ(Hsp40)，Hsp27，家族蛋白粒体蛋白P1前体(mitochondrial protein P1 precursor)等，这些成员广泛分布在原核生物及真核生物细胞中，它们在细胞蛋白质的折叠过程中相互协同，共同发挥着重要的作用。

线粒体基质蛋白P1前体在往线粒体内输入蛋白质和大分子装配中发挥作用，协助输入蛋白质的正确折叠，并能阻止错误的折叠和促进应激条件下产生的未折叠多肽的重折叠和正确的装配。伴侣素／线粒体蛋白P1前体在胎兔皮肤伤后表达增加，它们能协助其他蛋白和多肽的折叠、组装和转运、维持正确构象的微管蛋白和微丝蛋白，保持正确的细胞骨架促进伤口的愈合。

3．2波形蛋白和微管蛋白β多肽：波形蛋白(Vimmentin，Vim)是中等纤维的主要成分之一，在成纤维细胞中起到细胞支架与网络的作用。在皮肤结缔组织等间叶起源的细胞如：成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、某些肌肉细胞等中，中等纤维也以波形蛋白占绝大部分。有实验发现在脑穿刺伤后的神经胶质细胞中Vim及其mRNA的表达均增加，且与胶质瘢痕的形成关系密切：在深Ⅱ度和全层皮肤损伤愈合后挛缩瘢痕的研究中发现，波形蛋白在损伤后明显的增加，Vim的基因在增生性瘢痕中表达也增加，因此有研究者认为Vim与瘢痕增生有关。也有实验观察到在肌肉损伤和再生过程中Vim表达也增加，提示Vim可能在组织损伤后的再生和修复过程中发挥重要作用。

微管是真核细胞所独有的结构，存在于细胞基质，属于一种保守成分。微管主要由微管蛋白组成，是真核细胞普遍存在的细胞骨架，它还参与细胞的增殖、分化。B微管蛋白与细胞增殖分化有密切关系，当细胞从GO期进入S期使细胞由静止状态进入增殖状态时，必伴随β微管蛋白的基因表达及其蛋白合成。有实验发现用烧伤血清刺激大鼠肠上皮细胞后微管蛋白表达减弱，该现象可能与肠上皮损伤有关。

本实验发现Vim在伤后的胎兔皮肤组织中表达高于未致伤胎兔和伤后的成年免。可以试想Vim在成年个体伤后可能促进瘢痕的增生，而在胚胎时期可能具有调整胶原纤维的排列，抑制瘢痕增生的作用，从而促进胎兔创口组织的再生与愈合。胎兔伤后的皮肤中微管蛋白β多肽表达增多，也提示微管蛋白可能从促进细胞增殖、分化和保护上皮组织等方面在胎兔皮肤创伤的修复中起到一定作用。

3．3　核不均一核糖白H：核不均一核糖白(异质性胞核核糖白)(Heterogeneous nuclearribonucleoprotein，hnRNP、是一组RNA结合蛋白，它包括近30种与核酸结合的蛋白质，在基因转录、核内mRNA前处理以及胞质的mRNA翻译时起重要作用。hnRNP H是hnRNP家族的一个亚型，主要富集于细胞核内，它作为剪接增强子复合物的组成部分参与细胞的转录和翻译控制，其具体机制是hnRNP H能和相关蛋白如：hnRNP F等相互作用，其作用方式可能是hnRNP H和相关蛋白hnRNP F在单个增强子复合体中以异源二聚体的形式存在并相互作用，从而完成基因的剪接，调节基因的转录与翻译。Liu等体外实验发现hnRNP H通过对细胞转录、翻译的调控可以抑制干细胞的肌形成。本实验在创伤胎兔的皮肤中观察到hnRNP H的表达增加，它可能也通过对基因转录、翻译的调节实现对相关蛋白翻译的调控，从而发挥其在无瘢痕愈合中的作用。

3．4　α－烯醇酶：α－烯醇酶能调控缺氧诱导因子、核呼吸因子l，参与糖分解酶的调控，它还是细胞质中磷酸烯醇丙酮酸形成过程中重要的糖酵解酶。有学者发现烯醇酶可与人的纤溶酶原、唾液腺粘蛋白MG2结合，并可能在变形链球菌黏附、清除或突破血流屏障中起一定的作用。实验发现α－烯醇酶组成纤溶酶原的受体，而该受体通过在细胞表面富集纤溶蛋白酶或增强其生成，从而在骨骼肌形成过程中发挥重要作用。在小细胞肺癌中α－烯醇酶表达下调，并可能在肿瘤发生过程中起重要作用。但α－烯醇酶在创伤或皮肤组织中的作用和功能鲜有研究，因此其在胎兔皮肤组织无瘢痕愈合中的作用有待进一步研究阐明。

综上所述，本实验筛选出的蛋白与基因转录调控、细胞信号转导、细胞增殖、分化、发育等功能有关，这一结果与前期实验在创伤胎兔皮肤组织中筛选出与信号转导、细胞增殖、分化、发育相关基因的表达上调相互印证。因此可以设想：胎兔皮肤创伤后Vim、微管蛋白β多肽等促进细胞增殖、分化和发育，并维持其正常的细胞形态和结构；hnRNP H调控基因的转录和翻译，促进胶原蛋白等的合成：同时伴侣素协助多肽进行折叠、组装、转运，并能阻止错误的折叠和促进未折叠多肽的重折叠和正确的装配；α－烯醇酶可能以酶的身份参与其中，调节这些过程的完成。无瘢痕愈合相关蛋白通过这些作用，可能使胶原纤维等成分维持正常的排列，从而抑制瘢痕的过度增生，参与胎兔无瘢痕愈合过程。

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。