乳品中真蛋白SDS—PAGE检测及鉴定图谱库建立

【摘 要】本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术，建立乳品中真蛋白组份和含量的准确检测方法，建立乳制品蛋白质的组分及含量分析的SDS-PAGE图谱库，并制定该数据库相应的判定规则与方法；对待测乳品样品进行相应程序的分析，与标准比对进行乳品质量的判定与评价。如果样品本身质量优良，那就不必进一步进行假蛋白筛查；如果真蛋白检测指标有可疑，产品可能有掺假，就要进行掺假检测。

【关键词】聚丙烯酰胺凝胶电泳；乳品中真蛋白组份和含量检测；乳制品真蛋白质SDS-PAGE图谱库

近年来，乳品行业迅速发展，但由于市场需求大于奶源的供应，乳品生产中出现了掺假现象，以复原乳代替生鲜牛乳、乳品中添加氨基酸、淀粉类物质、用蛋白粉、脂肪粉等勾兑原料乳等问题的出现，扰乱了乳品行业的市场秩序，危害了人们的身体健康[1][2]。

乳中的氮含量包括蛋白态氮（Protein nitrogen，PN）和非蛋白态氮（Non-protein nitrogen，NPN），其中前者占95%，后者约占5%。蛋白质是乳中的主要含氮物质，含量2.8%-3.8%。乳蛋白包括酪蛋白、乳清蛋白及少量脂肪球膜蛋白。乳清蛋白中有对热不稳定的乳白蛋白和乳球蛋白[3]。真蛋白（true Protein，TP）即指这些除了非蛋白质氮以外的蛋白态氮所计算得到的蛋白，由于其可较好地反映乳品的真实营养价值，因此，真蛋白是乳品质量优劣的重要标志之一[4][5][6]。造假者利用劣质动物水解蛋白来提高蛋白质检测值的现象可能无法通过凯氏定氮法检测出来[3][7]。此外，紫外吸光光度法、比色法也是常用的蛋白质快速检测方法，但该方法易受到其他物质干扰，不适合复杂基质的样品分析，而氨基酸分析法受到蛋白质水解方法的限制，均对检测结果有影响[7]。

SDS-PAGE具有分子筛效应，根据蛋白分子量亚基的不同来分离蛋白，能够有效分离乳品中的主要蛋白质，达到定性、定量测定蛋白中主要蛋白成分的目的，是蛋白质分析中较为常用的方法，也是乳清蛋白研究中较为广泛的方法，该方法虽然不能有效分离乳清蛋白中的免疫球蛋白，但是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白能很好的分离开[8][9]。

本文采用SDS-PAGE方法检测不同乳品中真蛋白，并建立真蛋白SDS-PAGE鉴定图谱库。

1 材料和仪器

1.1 标准品和试剂

标准品：低分子量标准蛋白（15.5—97ku），大连宝生物工程公司；

标准蛋白及分子量：α-乳白蛋白14.3kD，β-乳球蛋白18.4kD，α-酪蛋白22.5kD，β-酪蛋白24kD，κ-酪蛋白23kD，都为优级纯（美国sigma公司）

大豆蛋白粉、明胶分析纯；丙烯酰胺（Acr） 、Tris 、N-N-甲叉双丙烯酰胺（Bis） 优级纯；TEMED；十二烷基硫酸钠（SDS） 优级纯；过硫酸铵（Ap） 分析纯；四甲基乙二胺（TEMED） 优级纯；巯基乙醇；BCA 优级纯（美国sigma公司）；碳酸钠、酒石酸二钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、硫酸铜、乙酸、过硫酸铵、甘油、溴酚蓝、甘氨酸、盐酸、甲酸等均为分析纯。

30%丙烯酰胺单体贮液，分离胶缓冲贮液，样品缓冲液，5.0mL浓缩胶缓冲贮液，电极缓冲液，染色液，固定液，脱色液按照相关参考文献制备。

1.2 材料

乳清粉为进口检验样品；奶粉样品为市售各种进口和国产品牌，来自不同厂家的奶粉样品。包括各个阶段婴幼儿奶粉、儿童奶粉、成人营养奶粉、老年人奶粉等。对于婴幼儿奶粉着重选取不同品牌的同一阶段奶粉进行比较，选取同一品牌各阶段奶粉，购自大连市各大超市。

1.3 仪器

SDS--PAGE电泳仪；电泳槽HoeferminiVE型；电泳仪BG.Power600型；UVP凝胶成像仪；高速冷冻离心机；727分栅分光光度计；DYY-6C电泳仪（北京市六一仪器厂）；DYCZ-24D型垂直板电泳槽（北京市六一仪器厂）。

2 方法

2.1 乳品中蛋白质组分和含量SDS-PAGE检测方法建立

2.1.1样品制备

根据文献报道[10]，制备样品。

奶粉：取1 g加入10 mL蒸馏水（60 ℃）溶解，加入0.6mol/L三氯乙酸1mL，振动混合5 min，分3次加入5 mL乙醚，1 500 r/min离心5 min。倾去醚层和水层，在沉淀的蛋白质中加入50mmol/L Tris.HCI（pH值为8.0），洗涤3次，洗去三氯乙酸，真空干燥成粉。测定可溶性蛋白质含量；称取蛋白10mg，测定蛋白质组成。

乳清粉：取1g加入10mL蒸馏水溶解，过0.45μ针头式过滤除脂，吸取滤液200μL，直接溶于1mL电泳上样缓冲液，测定蛋白质组成。

取400μL奶粉样品加入1ml 冷丙酮（-20℃）过夜沉淀，10000r/min 离心15min，沉淀加入1mL80% 冷丙酮（-20℃）洗涤3 次，真空干燥成粉。

蛋白质沉淀加入500μL 上样缓冲液，振动混合5 min，100℃水浴5min，10000r/min 离心5min 备用，上样为20μL。

2.1.2 SDS-PAGE电泳分析和含量测定

蛋白质沉淀加入，50mmol/L Tris-HCL缓冲液200μL，振动混合5min，100℃水浴5min，10000r/min离心5min备用；采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），浓缩胶浓度为4%，分析胶浓度为12%。电泳上样量为30μL，25mA恒流电泳5h；取出胶片用2.5%的考马斯亮兰染色4h，用甲醇/冰醋酸脱色液脱至透明。

胶片采用UVP凝胶成像仪（Ultra-Violet 公司产品）摄像及分析。

2.2 SDS-PAGE鉴定图谱库建立

将蛋白标准品图谱、已测定的全脂乳粉及乳清粉图谱添加至鉴定图谱库中，根据上文所建立的方法，对近百个奶粉样品进行SDS-PAGE检测，建立的SDS-PAGE图谱库。

3 结果与讨论

本文利用SDS-PAGE电泳结合凝胶成像分析了近百种奶粉中的蛋白组成，建立了市售常见的各个阶段婴幼儿奶粉、儿童奶粉、成人营养奶粉等样品中真蛋白质SDS-PAGE鉴定图谱库。本文中只给出了所建立的图谱库的部分结果（图1—图6）。

分析实验结果，采用SDS-PAGE电泳方法，可以快速简单分离出奶粉中的各个蛋白质组分，结合蛋白质标准品，确定各个组分的是何种蛋白质成分，并进行相对含量分析。结合相应的分析软件，能较准确地检测出奶粉蛋白质各个组分的含量，进行各样品蛋白质质量及绝对含量分析。

目前常规蛋白质检验方法，不能确切反映乳品蛋白质的含量、来源和组成，对于在乳中掺入廉价的水解蛋白或在牛乳中掺入其他动物乳等新的掺假方式，传统的检测方法难以检出。现行的乳品掺假检验研究，大多针对某假定的单一物质进行定性定量，要实现多个掺假物的检测操作繁琐，尤其是对乳品中可能出现的未知物难以评判。我国乳品检测急需建立适应新掺假情况的快速、准确的检测方法，找到直接测定真蛋白质含量的可靠方法，这是彻底堵住假蛋白掺假的唯一手段。如果能够一次直接测定食品中真蛋白质含量，就会堵住了市场监管上的漏洞，使伪劣产品无所遁形。

分析本文的实验结果，可见所有产品中各蛋白质相对含量均在乳蛋白的正常范围内，没有添加明胶、大豆蛋白等异源蛋白。部分产品β-乳球蛋白含量稍高于其它同类产品。所有样品中几乎不含其他蛋白质如明胶蛋白、大豆蛋白等异源掺假蛋白。与文献报道一致，电泳中к-酪蛋白（分子量19023）和β-LG（分子量18362）未能分开。由于к酪蛋白是由多种聚合体组成的混合物，其凝胶电泳一般呈现几条谱带，其中迁移率最慢的泳带由于不含碳水化合物，最易被染色。由于牛奶中的酪蛋白不易消化，因此在婴幼儿一段奶粉中酪蛋白的添加比例，相比其它阶段奶粉酪蛋白添加量要少；分析不同阶段的婴幼儿奶粉具有不同浓度的蛋白组成，二段、三段奶粉中酪蛋白添加量逐渐增加。在学生营养奶粉和学生甜奶粉中，酪蛋白含量最高。

本文采用SDS-PAGE方法检测不同乳品中真蛋白，并建立真蛋白SDS-PAGE鉴定图谱库。并制定该数据库相应的判定规则与方法；对待测乳品样品进行相应程序的分析，与标准比对进行乳品质量的判定与评价。如果样品本身质量优良，那就不必进一步进行假蛋白筛查；如果真蛋白检测指标有可疑，产品可能有掺假，就要进行掺假检测。分别测定真蛋白质和假蛋白质，去劣存真，堵塞监管漏洞，以保护婴幼儿身体健康，维护广大消费者的切身利益。

参考文献：

[1]赵光华，胡京枝，金明奎.乳品中常见掺假手段及其鉴别.[J]. 农业质量标准.2007，4：30-31

[2]孟宪娇.乳与乳制品中蛋白质风险指标体系的建立.[D].中南林业科技大学.2010.

[3]刘东红，唐佳妮，吕元等.乳品真蛋白--定义、分析方法、计价及影响因素.[J]. 中国食品学报.2008，8（5）：115-119

[4]唐佳妮，吕元.国内外乳品真蛋白检测方法的进展[J].食品与发酵工业，2009，35（4）：119-123.

[5]陈静，王玉英，王婷婷等.生鲜牛乳真蛋白快速检测方法.[J]. 中国乳品工业.2012，38（11）50-52

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[7] 李红霞，骆玉涵，张会宜.乳品中蛋白质检测方法的研究进展.[J].中国乳品工业.2012，40（6）：53-57；；

[8] 张杉，陈敏，李慧.SDS-PAGE电泳测定乳清蛋白方法的研究.[J]. 食品科技.2008，33：215-219

[9] 金江玉，宋子明，史海莹等.SDS-PAGE凝胶电泳在鉴别水解蛋白掺假液态乳中的应用.[J].中国乳品工业.2012，40（7）：4-7

[10] 陈玉铭，杨晓泉，赵谋明.SDS-PAGE法分析含乳饮料和乳清粉的蛋白组成和含量[J]. 中国乳品工业.2001，29（4）.