大鼠颅骨矢状缝牵引成骨的体外研究

[摘要]目的：探讨建立幼年SD大鼠颅骨器官体外培养的方法，研究外源性张力对颅骨矢状缝成骨活动的影响。方法：取19日龄的SD大鼠颅顶骨矢状缝组织块，试验组加0.4 g力，对照组不加力。经器官培养后进行组织学观察和免疫组织化学检查，并检查胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）等mRNA的变化情况。结果：试验组骨缝内成骨细胞活跃，IGF-1阳性染色位于颅缝内成骨细胞，实验组IGF-1 mRNA 表达量高于对照组。 结论：大鼠颅骨骨缝器官可在体外培养中成功存活并生长。外源机械张力可以扩宽骨缝，刺激成骨活动，可显著增加IGF-1的合成。

[关键词]颅缝；器官培养技术；胰岛素样生长因子-1；机械张力

[中图分类号]R785[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）07-1015-04

Osteogenic effect of tensile force to the cranial sagittal suture of rats in vitro

WU Di1,WANG Xin-gang2,ZHAO Zhen-min1

(1.Department of Cleft Lip and Palate, Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100144；2.Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Beijing Children Hospital, Capital Medical University, Beijing 100045,China)

Abstract：ObjectiveTo develop an in vitro model for cranial suture of neonatal SD rat, and explore the osteogenic effect of exogenous tensile force.MethodsThe parietal bones with the sagittal suture were removed from SD rats (19-days old) for organ culture. In the experimental group, tensile force(0.4g) were applied by helical springs, whereas no tension (0g) were set in the control group. We dissected sagittal suture for RT-PCR. The changes of IGF-1 mRNA was investigated. Then the explants cultured for 24 hours were removed for histological observation and immunohistochemistry examination.ResultsIn the experimental group, osteoblasts and capillary vessels proliferated actively in the suture. IGF-1 mRNA were increased significantly. After immunohistochemistry staining, IGF-1、IGF-1R and PCNA were positive in osteoblasts and fibroblasts.ConclusionIn vitro model of cranial suture can be cultured successively. Exogenous tensile force has osteogenic effect in cranial suture, which companied by significant increase of IGF-1 level.

Key words: cranial suture; organ culture techniques; insulin-like growth factor； tensile force

骨缝是颅面骨骼生长的主要部位，被硬脑膜等组织包绕，位于坚硬的骨骼之间。体外实验是将离体骨缝组织置于培养基中进行牵引，这不仅避免了体内综合因素的影响，还可单独对缝组织施加某种条件，以明确它的作用。

目前, 关于牵引力诱导成骨活动的分子生物学机制远未阐明, 考虑到骨生长因子及Ⅰ型胶原在骨组织再生和修复过程中的重要作用，我们通过建立大鼠颅骨矢状缝牵引成骨的体外模型,探讨力学刺激对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）、IGF-1受体（IGF-1R）及Ⅰ型胶原（collagen, type I，COL1）的影响。

1材料和方法

1.1 牵引装置的制备：按照Hickory和Nanda 的方法设计螺旋弹簧[1]。应用直径为0.25mm的正畸矫治钢丝弯制成螺旋弹簧，弹簧体部伸出两臂，臂分为水平部分和末端向下弯曲90°的垂直部分。弹簧直径是4mm，圈数为6圈。臂水平部分长为50mm，垂直部分为7mm。当两臂末端压缩至距离为7mm时即为0.4g的张力，当垂直置入部分用胶布固定时即为0g张力。

1.2 动物标本的切取：选用19日龄的SD大鼠60只（由北京维通利华公司提供）。术区消毒后，在解剖显微镜下暴露颅盖骨，包括两侧的顶骨及其间的矢状缝，宽为8mm，长为10mm，保留颅骨外膜和硬脑膜。其中30只用于RT-PCR研究，30只用于免疫组织化学检查。并分别随机分成对照组（不加力）和试验组（加力0.4g）进行体外培养。分组情况见表1。

1.3 器官培养：将颅盖骨标本放入装有无酚红高糖型DMEM的培养皿中，在37℃、5%的CO2孵育箱中孵育60min，以使在组织学处理时骨缝组织中受伤的细胞恢复。60min后安置弹簧，置于DMEM培养基，在37℃、5%的CO2孵育箱中培养。培养基中加入10%的胎牛血清、青霉素、链霉素(图1)。

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1.4 苏木精-伊红染色和免疫组化检测：将30只标本培养24h后，于10%中性甲醛固定10h，用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液（由中杉金桥试剂公司提供）脱钙，常规脱水，石蜡包埋，制作4微米厚切片，分别用于苏木精-伊红染色和免疫组化检测。免疫组化所用抗体为：兔抗大鼠多克隆IGF1抗体，兔抗大鼠多克隆IGF1R抗体，小鼠抗大鼠单克隆PCNA抗体，兔抗大鼠多克隆Ⅰ型胶原α1抗体，即用型SABC免疫组化染色试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。染色方法按免疫组化SABC法进行。

1.5 RT-PCR

1.5.1 主要试剂：Trizonl Reagent（Invitrogen，美国），mRNA Selective PCR Ver.1.1（TaKaRa，日本），TaKaRa Ex Taq?（TaKaRa，日本）。IGF-1、COL1A1（collagen, type I, alpha 1, COL1A1）及β-actin 引物根据Gen Bank 数据库报告序列，使用Primer Premier 5.0 软件辅助设计引物,由上海申能生物技术公司合成（表2）

1.5.2 实验步骤：用于RT-PCR的30只标本，安置弹簧后分别培养0.5h、3h、6h。在解剖显微镜下将培养标本取中间矢状缝组织。先将新鲜颅缝组织剪成小块，放入匀浆器内，加入800微升Trizol用匀浆器匀浆，然后转移至新的离心管中。采用Trizol一步法提取总RNA。取RNA模板1微克，配制RT反应液50μl。将反应体系混匀，30℃10min ,42℃10min， 5℃5min进行逆转录，反应所得cDNA 产物用于PCR反应。每个样本取10μlcDNA产物, 按试剂盒说明组成PCR反应体系，体系总量50μl。β-actin 为内参。放入PCR热循环仪(Biometra公司) 内,按下列程序设置：IGF-1及β-actin：为94℃30s, 50℃30s,72℃1min,共30个循环。Ⅰ型胶原为94℃30s, 56℃30s,72℃1min, 共30个循环。

反应结束后，取PCR反应液5～10μl进行琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物，Gene Snap From Syngene软件下测定不同条带的灰度值，以每例组织电泳带面积灰度值与β-actin 电泳带面积灰度值之比作为该例标本目的基因表达的相对值，行半定量比较。各项计量指标均以平均值±标准差（x±s）表示。数据采用Excel 2003 进行汇总与绘图；统计软件SPSS 13.0进行统计分析，检验水准α＝0.05。一般性描述用 和柱形图来表示；各实验组和对照组比较采用配对样本t检验；各时间段之间比较采用两因素方差分析（Two-Way ANOVA）。

2结果

2.1 大体观察：大鼠颅骨标本经体外培养24h后，标本未见坏死。对照组骨缝未见明显变化。试验组应用弹力簧进行缝牵引后，骨缝逐渐加宽，至加力24h所有标本矢状缝未见断裂。

2.2 倒置显微镜下观察：于低倍倒置显微镜下观察，培养液镜下观察未见细菌污染，颅骨标本未见坏死。对照组骨缝未见明显变化。试验组应用弹力簧牵引后，骨缝逐渐加宽，至加力24h，所有标本矢状缝未见断裂，与大体观察相吻合。（图2）

2.3组织学表现：HE染色可见，缝两侧区域为成骨活跃部位，两侧骨化前沿交错排列。缝内可见纤维结缔组织，可见成骨细胞、成纤维细胞及毛细血管，缝内组织与硬脑膜相连；两侧骨化前沿可见有成骨样细胞，说明不断有新骨形成。对照组标本骨缝保持正常发育，以成骨细胞为主。试验组标本骨缝明显增宽，缝内成骨细胞活跃，毛细血管增生。对照组和试验组均未见组织坏死。

2.4免疫组化：IGF-1及IGF-1R阳性染色位于颅缝内成骨细胞及成纤维细胞，实验组强于对照组（图3）。I 型胶原免疫组化阳性染色位于颅缝内结缔组织、硬脑膜、骨膜，实验组与对照组比较无明显差异。PCNA代表细胞增值活跃情况，颅缝内实验组PCNA染色阳性细胞位于成骨细胞及成纤维细胞，明显强于对照组。

2.5 RT-PCR：RT-PCR 扩增后，得到IGF-1为398bp，β-actin为276bp,符合预计结果(图4)。实验组及对照组IGF-1表达强度的比较：各实验组与对照组比较，第0.5h、3h、6 hIGF-1 mRNA 表达量均有增高，经配对样本t检验分析结果有显著性差异：0.5h（t=-5.216，p=0.006），3h（t＝-6.289，p=0.003），6h(t＝-3.365，p=0.028)。三个时间段mRNA表达量经两因素方差分析无显著性差异。

02

RT-PCR 扩增后, 得到I 型胶原 为111bp，β-actin为276bp,符合预计结果(图4)。实验组及对照组I 型胶原表达强度的比较：各实验组与对照组I 型胶原 mRNA 表达量经t检验无统计学差异。0.5h、3h、6 hI 型胶原 mRNA 表达量经两因素方差分析无显著性差异。

3讨论

机械张力对颅面骨缝作用的实验研究主要分为体内和体外两种。体内试验是对不同动物的骨缝施加直接或间接张力，观察受力后缝的变化情况。其中间接张力可以来自缝周围的牙齿或肌肉，通过改变牙齿或肌肉的力量间接影响骨缝的受力程度。先前的体内试验，加力系统力值通常在作用于被研究的颅面骨缝之前就被测量，由于颅面结构的复杂性，在加力系统作用于颅面骨缝时，有部分力作用于颅面骨缝之外的其它结构。因此，很难通过体内试验研究力的变化和组织学反应之间的相关性，体内试验研究不能真实反映骨缝受外力作用后的骨改建情况。

体外实验是将离体骨缝组织置于培养基中进行牵引，这避免了骨缝周围组织和全身因素的影响。因此本试验选用体外研究方法。自制螺旋弹簧，以颅缝为中心，两侧正中打孔安置弹簧，孔距7mm。当弹簧压缩为7mm时产生0.4g张力，这样控制弹簧力的大小和方向，避免旋转。

几乎所有的颅面骨缝都被用到过张力研究中，其中矢状缝和冠状缝是最常用的。选择骨缝一个很重要的原则是易于获取，覆盖颅骨矢状缝的软组织血供少，又无肌肉附着，远离口鼻区域，切取标本及培养时不容易污染。因此本试验选择颅骨矢状缝为研究对象。

组织学分析是反映骨缝生长发育的一个实用指标。本试验模型的组织学观察是：对照组标本骨缝保持正常发育，以成骨细胞为主。试验组标本骨缝明显增宽，缝内成骨细胞活跃，毛细血管增生。未见组织坏死和细菌感染。提示骨缝器官能在体外培养中存活并能继续生长发育，证明本模型建立成功。骨缝器官培养与细胞培养相比更接近于机体内的生长情况，所以体外器官培养在机械张力对颅面骨缝成骨作用的研究中有实用价值。

在机械张力的作用下，主要由骨缝中的成骨细胞和成纤维细胞分泌多种细胞因子，包括IGF、TGF-β、BMP、bFGF[2]等，它们通过自分泌和旁分泌调节成骨细胞的活性。IGF-1可以促进成骨细胞增生。Bradley等人[3]研究认为IGF-1、IGF-2的mRNA以及 IGF-1蛋白在大鼠正在融合的骨缝中高表达，从而推断IGF通过旁分泌促进骨缝融合。

选用19日龄的SD大鼠，将离体骨缝组织置于培养基中进行牵引，实验组及对照组IGF-1 表达强度的比较发现，实验组第0.5h、3h、6 hIGF-1 mRNA 表达量均高于对照组。免疫组化结果表明，IGF-1及IGF-1R阳性染色位于颅缝内成骨细胞及成纤维细胞，实验组强于对照组。这些结果与Hirukawa等人[4]研究发现相吻合。以上研究表明，成骨细胞及成纤维细胞可能存在对力学刺激的感受器，在适当力学刺激下，通过这些感受器作用于成骨细胞及成纤维细胞，促进了IGF-1的分泌，进而促进成骨活动。

增殖细胞核抗原是一种相对分子质量为 36 000的酸性无组蛋白成分的细胞核多肽[5]。它是真核细胞DNA合成所必需的。增殖细胞核抗原在静止期细胞中含量最少，在G1期升高，S期达到最高水平。有研究表明，增殖细胞核抗原的合成与表达与细胞增殖密切相关，能有效地反映细胞的增殖活性[6]。在颅缝组织内适当张力刺激与细胞增生情况呈正相关[1]。我们通过免疫组化证实，颅缝内实验组PCNA染色阳性细胞位于成骨细胞及成纤维细胞，明显强于对照组，适当力学刺激促进了细胞增生。

成骨细胞的生长过程一般是分化增殖、基质形成和基质钙化三个时期。I 型胶原分泌是骨基质形成的特征性表现[7]。I 型胶原免疫组化阳性染色位于颅缝内结缔组织，硬脑膜，骨膜，实验组与对照组比较无明显差异。RT-PCR结果显示，实验组第0.5h、3h、6 hI 型胶原 mRNA 表达量与对照组比较无统计学差异。因此，在力学刺激早期，可能尚未对成骨细胞的基质形成产生影响。

通过上述实验，我们认为大鼠颅骨骨缝器官可以在体外培养中成功存活并继续生长。外源机械张力可以扩宽骨缝，刺激成骨活动，可显著增加IGF-1的合成。

[参考文献]

[1]Hickory WB, Nanda R. Effect of tensile force magnitude on release of cranial suture. cells into S phase[J]. Am J Orthod Dentofac Orthop, 1987, 91(4):328-334.

[2]高全文，柳春明.力学刺激对骨缝调节的研究进展[J].中华老年口腔医学杂志,2006,4（2）：119-121.

[3]Bradley JP, Han VK, Roth DA, et al. Increased IGF-I and IGF-II mRNA and IGF-I peptide in fusing rat cranial sutures suggest evidence for a paracrine role of insulin-like growth factors in suture fusion[J]. Plast Reconstr Surg,1999, 104（1）:129-138.

[4]Hirukawa K, Miyazawa K, Maeda H, et al. Effect of tensile force on the expression of IGF-I and IGF-I receptor in the organ-cultured rat cranial suture[J]. Arch Oral Biol,2005,50(3):367-372.

[5]Hall FA, Levison DA, Woods AL, et al. Proliferating cell nuclear antigen PCNA immunolocalization in paraffin sections an index of cell proliferation with evidence of deregulated expression in some neoplasmas[J]. J Pathol,1990,162(4):285-294.

[6]Sato I, Sunohara M, Micami A, et al. Immunocytochemical study of the maxilla and maxillary sinus during human fetal development[J]. Okajmas Folia Anat Jpn,1998,75（4）205-216.

[6]胡 静，邹淑娟，高占巍,等. 机械牵张对人成骨细胞ALP活性及Ⅰ型胶原表达的影响[J]. 口腔颌面外科杂志,2003,13(1): 11-13.

[收稿日期]2008-03-26[修回日期]2008-06-19