大鼠Munc13研究论文

【摘要】目的：研究大鼠胰腺发育不同阶段Munc131基因及蛋白表达的变化及Munc131在胰岛素释放过程中的作用.方法：应用显微分离及提取技术获得大鼠胚胎发育12.5d（E12.5）,E15.5,E18.5,新生大鼠,出生后21d（P21）及成年大鼠胰腺组织；另外，从大鼠胚胎发育15d开始给予孕鼠半量饮食，造成宫内发育迟缓动物模型，提取其新生大鼠胰腺组织.采用RTPCR,RealtimePCR和Westernblot技术确定Munc131的表达情况，并测定不同发育时期血中胰岛素浓度.结果：胰岛素基因从E12.5开始出现，Munc131基因从E15.5开始表达，随着胎龄的增长，二者表达量皆增多.E15.5和E18.5时munc131蛋白表达量较少，以后明显增多.自E18.5即检测到血中胰岛素的存在，随着胚胎的发育，血胰岛素浓度逐渐升高.宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低，同时Munc131基因及蛋白表达量亦比正常对照组明显减少.结论：Munc131在胰岛素释放过程中的作用，随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多表达也增加，宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时，Munc131的表达亦减少.

【关键词】Munc131；胰岛素/分泌；胚胎胰腺发育；糖尿病；宫内发育迟缓

0引言

胰岛素在β细胞内合成后，以分泌颗粒的形式贮存在大致密囊泡中，在营养物质（葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等）、神经递质、激素等刺激下，进入血循环，完成其调节体内营养物质代谢，调节生长发育，控制血糖动态平衡的生理作用［1-2］.业已证实，胞吐过程是涉及许多蛋白因子的复杂过程，可溶性N甲基马来酰胺融合蛋白附着蛋白受体(solublenethylmaleimidesensitivefusionproteinattachmentproteinreceptors,SNARE)复合体是胞吐过程所必须的分子构件；Munc，Synaptotagmin，Rab等蛋白家族的不同成员是其重要的调节因子.这些因子在神经递质胞吐中研究得较多，但他们在胰岛素分泌过程中的确切作用及其精细功能如何尚无定论［3-5］.我们运用基因芯片技术，已建立了大鼠不同发育阶段基因表达谱，初步明确了胰岛素释放的完善过程中相关基因的表达情况，在此基础上，我们重点从胰岛素释放关键因子之一Munc131入手，探讨正常及异常胰腺发育情况下Munc131表达的变化，阐述其在胰岛素释放过程中所起的重要作用，以期寻找糖尿病治疗的新靶点.

1材料和方法

1.1材料SD大鼠由南京医科大学实验动物中心提供.18：00将雌雄鼠合笼，次日晨检测有阴栓者定为孕0.5d（E0.5），分别于受精后12.5d(E12.5),15.5d(E15.5),18.5d(E18.5)，经颈椎脱臼处死孕鼠，剖腹取出孕子宫，分离胚胎，取出胰腺（E12.5,E15.5胚胎胰腺需在解剖显微镜下分离），新生鼠出生后，立即与母体分离，迅速取出其胰腺.出生后21d鼠和成年鼠在低温条件下迅速取出胰腺［6］.部分孕鼠于E15开始给予正常卡路里的50%，直至出生，造成宫内发育迟缓动物模型，待新生鼠出生后，立即取出其胰腺.所有标本置液氮中速冻后-70℃冻存备用.分别取E12.5胚胎胰腺100只、E15.5胚胎胰腺30只，E18.5胚胎胰腺10只（来自3只孕鼠）,新生鼠3只（来自3只孕鼠），用RneasyMiniKit（Qiagen公司）抽提并纯化总RNA.总RNA分装后-70℃冻存，用于RTPCR和RealtimePCR.

1.2方法RTPCR和RealtimePCRRTPCR操作过程按试剂盒（日本Toyoko公司）提供常规步骤.目的基因及内参照引物序列如下：G3PDHforward:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,reverse:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′.Insulinforward:5′CCGTCGTGAAGTGGAG3′,reverse:5′CAGTTGGTAGAGGGAGCAG3′.PDX1forward:5′GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAA3′,reverse:5′CCAGTCTCGGTTCCATTCG3′.Munc131forward:5′TGTGGAACAAGGGTCTCATCTGG3′.reverse:5′GGCTGCGAAGTCGTGTAGTAAGG－3′.Munc131RealtimePCR探针设计如下：unc13h1fam:CCAAGCCATGACCCACTTTGCCTG，unc13h1fp:CGCTATGGCGTTGAATCCA，unc13h1rp:TGCGTAGTAGGCGTTGATGTTG.分别取E15.5的胰腺100只,E18.5的胰腺20只,新生大鼠胰腺6只,出生后21d大鼠6只、成年大鼠6只（雌雄各3只），分别按1∶5（m/V）加裂解液（50mmol/LTrisCl,150mmol/LNaCl,1g/LSDS,100mg/LPMSF,10g/LNP40,10g/LTritonX100,10g/L蛋白酶抑制剂cocktail），冰上匀浆，然后300W超声4s×14（间隔时间）×6次（保护、工作复位），静置1h后，21500g离心15min，提取上清为总蛋白，用Braford法测蛋白浓度，分装后-70℃冻存备用.将上述提取的胰腺发育各时期的总蛋白,进行SDSPAGE,转膜后以Munc131（小鼠，针对621~834氨基酸，BD公司）为一抗，羊抗小鼠IgG为二抗进行杂交，检测其相对分子质量.另取E18.5、新生大鼠和成年大鼠血标本各6份，运用胰岛素ELISA试剂盒（Linco公司）检测血中胰岛素水平.

2结果

胰腺内分泌细胞的一些标志物如insulin，PDX1等基因在所取胰腺皆有表达，证明我们的取材是准确无误的.

2.1胰腺发育各阶段Munc131基因及蛋白的表达Munc131从E15.5开始表达，以后一直持续存在；同时，胰岛素基因从E12.5开始出现，随着胎龄的增长表达量增多（图1）.RealtimePCR结果与RTPCR结果趋势一致.Westernblot结果显示，在Mr1.97×105处出现杂交带,此与文献报道的Munc131抗原的相对分子质量相一致.E15.5和E18.5时Munc131蛋白表达量较少，新生以后表达量明显增多.

M：Marker；N：新生大鼠；P21：出生后21d大鼠；A：成年大鼠.

图1大鼠胰腺中Munc131,insulin的表达（RTPCR）（略）

A:正常大鼠；B:宫内发育迟缓新生大鼠.N：新生大鼠；IUGR：宫内发育迟缓新生大鼠.

图2胰腺中Munc131蛋白的表达（Westernblot）（略）

2.2宫内发育迟缓新生大鼠Munc131基因及蛋白的表达与正常新生大鼠相比，宫内发育迟缓新生大鼠insulin基因表达无明显变化，PDX1表达相对减少，而Munc131的基因表达明显减少（图3）.宫内发育迟缓新生大鼠Munc131蛋白表达量比正常对照组明显减少（图2B）.

N:正常新生大鼠；IUGR：宫内发育迟缓新生大鼠.

图3正常及宫内发育迟缓新生大鼠insulin，PDX1，Munc131的基因表达（略）

2.3大鼠不同发育阶段血胰岛素水平自E18.5即检测到血中胰岛素的存在，但浓度较低，随着胚胎的发育，血胰岛素浓度明显升高，新生和成年期血胰岛素水平无显著差异.另外，宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素浓度低.

3讨论

胞吐是胰岛素释放出β细胞的重要过程.胰岛素分泌颗粒分别位于贮存池（约95%～99％）和释放池（约1%～5％），释放池的胰岛素颗粒经过胞吐介导一相胰岛素分泌，贮存池的胰岛素颗粒经过转位、锚定、成熟等过程，补充释放池的不足，完成二相胰岛素分泌.虽然循环胰岛素的量与胰岛素合成有关，但与胰岛素释放的调节关系更加密切［7-9］，本实验室最近的结果显示，上述胰岛素分泌关键因子在胚胎及成年大鼠胰腺有表达（结果未列），为明确各关键因子的具体作用，我们首先选择了Munc131作进一步的研究.Munc家族成员中较重要的是Munc13（包括Munc131，Munc132，Munc133）和munc18.有研究提示，Munc131不仅可以与Munc18结合，使Munc18与syntaxin解离，还能直接作用于syntaxin，使syntaxin从syntaxinMunc18复合体中游离出来，此时SNARE复合体才能从没有胞吐能力的松散状态变成致密复合体，促使胞吐的发生［10-12］.但Munc131在胰岛素分泌过程中的确切作用显有报道，对其胚胎发育期的研究更是少.我们发现，大鼠E12.5胰岛素基因即开始表达，Munc131从E15.5开始出现，说明胚胎胰腺发育早期即有了合成胰岛素的能力，随后才出现胰岛素胞吐关键调节基因，随着胚胎的生长，二者表达量增多.Munc131蛋白在E15.5，E18.5已有少量表达，出生以后表达明显增多，与基因水平表达趋势基本一致.另宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠血胰岛素水平降低，从基因水平及蛋白水平上看，宫内发育迟缓新生大鼠比正常新生大鼠Munc131的表达明显减少，而胰岛素基因的表达无明显变化，这提示宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素的合成能力可能不变，其血胰岛素水平下降可能发生在胰岛素释放的环节，即可能是Munc131等胞吐调节因子表达下降，从而造成胰岛素胞吐能力减弱，导致循环胰岛素减少.

因此，我们可以得出以下结论：①大鼠胚胎胰腺有分泌胰岛素的能力，以调节自身血糖水平，但胚胎发育晚期才开始有较多的胰岛素分泌，且随着胚胎生长，胰岛素分泌增多；②Munc131在胰岛素释放过程中起着重要作用，随着胚胎发育期胰岛素分泌的增多，Munc131的表达同时增多，而宫内发育迟缓新生大鼠胰岛素分泌减少时，Munc131的表达亦减少.

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