积雪草苷防治支架再狭窄的生化调节机制

[摘要] 目的：探讨积雪草苷能否作为生化调节剂，有效减轻内皮细胞损伤，进一步抑制支架术后内中膜增生。方法：选取原代人主动脉平滑肌细胞和主动脉成纤维细胞各1株，每株细胞设空白对照组、雷帕霉素组（Rapa）、积雪草苷组（At）、积雪草苷+雷帕霉素组。利用qRT-PCR检测平滑肌细胞和成纤维细胞TGF-β1（转化生长因子1），Smad7，I型胶原基因表达水平，通过ELISA检测I型胶原蛋白表达量，计算积雪草苷和雷帕霉素两药相互作用指数（CDI）。另将16只中华小型猪随机分为A，B 2组，前降支球囊大压力预扩后，植入同型雷帕霉素支架1枚。术后A组予生理盐水30 mL·d-1静脉注射；B组予积雪草苷30 mg·kg-1·d-1 （生理盐水稀释至30 mL）静注。术后7，14 d ELISA法检测2组血浆vWF（血管性血友病因子）表达水平；术后28 d复查冠脉造影，取支架血管段组织切片及染色，计算血管面积、支架内面积、管腔面积和新生内膜面积。结果：与对照组相比，两药联合组显著上调平滑肌细胞和成纤维细胞Smad7基因，下调TGF-β1，显著抑制I型胶原基因表达（P

[关键词] 积雪草苷；雷帕霉素；Smad7；生化调节剂

[收稿日期] 2013-09-24

[基金项目] 上海市自然科学基金项目（11ZR1431800）；上海市浦东新区领先人才基金项目（PWR12010-03）

[通信作者] 李新明，博士生导师，E-mail：.cn

[作者简介] 侯士强，硕士研究生，E-mail：

支架术后再狭窄和支架术后迟发性血栓是目前经皮冠脉介入治疗（PCI）的主要问题。胞外基质（ECM）约占支架术后再狭窄成分的80%，主要为I型胶原蛋白、弹力蛋白及α-平滑肌肌动蛋白，TGF-β1是调节ECM分泌的关键因子[1-5]。药物支架在抑制血管外膜成纤维细胞表型转化和抑制内中膜平滑肌细胞增殖的同时，也有效抑制了内皮细胞增殖和修复，导致亚急性、迟发性支架内血栓形成[6-7]。临床上一直试图寻找一种既能“显著抑制增殖”，又具有“内皮友好”功能的支架涂层药物，但效果不佳。积雪草苷是积雪草中提取的单一大分子化合物，在皮肤创伤治疗中具有抗炎和抗氧化作用，抑制成纤维细胞及胞外基质合成，防止瘢痕生成[8-10]。近年来研究发现，积雪草苷可诱导肿瘤细胞凋亡，并与长春新碱显示协同作用[11]。鉴于以往研究经验，本研究决定在不摒弃抗增殖药物同时，根据免疫抑制剂特性，引入肿瘤治疗领域中的“生化调节剂”概念。希望通过雷帕霉素联合积雪草苷，能够减轻内皮细胞损伤，进一步抑制支架术后内中膜增生。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器 原代人主动脉平滑肌细胞株及培养基（美国Sciencell公司）；原代人主动脉成纤维细胞株及培养基（美国Sciencell公司）；反转录试剂（美国Invitoren公司）；定量PCR试剂（日本Takara公司）；积雪草苷（苏州宝泽堂）；雷帕霉素（上海微创公司）；引物由上海英骏生物有限公司设计合成。普通级中华实验用小型猪16只（华东师范大学闵行实验动物中心），体重25～35 kg，雌雄不限，6～8月龄；2.5/3.0 mm×15 mm雷帕霉素支架（上海微创公司）。

1.2 细胞传代培养和加药 人主动脉成纤维和主动脉平滑肌细胞株各传1代，分别使用ECM，FM，SM专用培养基，在37 ℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，隔天换液1次，待细胞均匀铺满瓶底后，用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化收集。将每株细胞按培养条件均分为对照组（Blank，加入溶剂二甲亚砜，DMSO），雷帕霉素组（Rapa，1×10-9mol·L-1），积雪草苷组（At，1×10-5mol·L-1），积雪草苷+雷帕霉素组（Combination，1×10-5mol·L-1+1×10-9mol·L-1），加药后，培养48 h。收集上清，12 000 r·min-1离心15 min后，吸取上清，-20 ℃保存，用于后续ELISA实验。收集细胞，直接抽提RNA，用于后续qRT-PCR检测。

1.3 RT-PCR检测 -80 ℃冰箱中取出RNA，0.2 mL PCR管中配置逆转录反应混合溶液，预变性后在PCR管中配制cDNA第一链合成反应体系。根据每基因进行3孔平行反应的量，在PCR 8联管中配制反应体系。将PCR管置于PCR仪，95 ℃ 30 s；随后40个循环：95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s。仪器使用ABI Prism 7900。引物序列见表1。

1.4 ELISA检测及CDI计算 -20 ℃冰箱中取出上清，室温下解冻，ELISA标准孔设置浓度梯度，样品组每个样本设3个孔，每孔加10 μL样品，孵育30 min弃去液体，洗板5次，然后加酶标抗体孵育30 min，弃去液体洗板5次，加显色剂避光孵育15 min，加终止液，酶标仪测定A并计算出相应浓度。计算两药联合作用指数（CDI），CDI=AB/（A×B），AB为两药联用组与对照组吸光度比值，A或B是各药物单独用药组与对照组吸光度比值。理论上当CDI

1.5 动物分组及再狭窄模型制备 将16只中华小型猪随机分为A，B 2组，每组8只。所有小型猪术前3 d，每日喂服阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg。术前予小型猪安定3 mg·kg-1，氯胺酮10 mg·kg-1肌注麻醉，必要时静脉追加3%戊巴比妥钠3～5 mL。常规消毒铺巾，手术分离右侧股动脉，直视下穿刺置鞘，并予肝素200 U·kg-1；行左、右冠脉造影，选取前降支直径约2.5～3.0 mm的较平直血管段，定量冠脉造影（QCA）软件测量直径；送入预扩张球囊，定位于前降支目标血管段，按球囊/血管直径1.2∶1，以16个大气压8～10 s快速预扩张，并前后轻微拉动球囊，损伤血管内中膜；送入雷帕霉素支架，完全覆盖预扩张部位，按球囊/血管直径1.2∶1，以14～16个大气压，过度扩张10～15 s释放；退出支架球囊，重复冠脉造影，排除血管夹层和血栓，确保冠脉前向血流（TIMI）3级；结束手术，缝合股动脉及皮肤。术后每日仍予阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg喂服，术后A组予生理盐水30 mL·d-1静脉注射；B组予积雪草苷30 mg·kg-1·d-1 （生理盐水稀释至30 mL）静注，直至28 d时动物处死。

1.6 ELISA法测定小型猪血浆vWF 术后7，14 d分别采集A，B 2组小型猪静脉血，试管中加入0.109 mol·L-1枸椽酸钠抗凝液（与血液按体积1∶9混合），置于离心机3 000 r·min-1离心10 min，收集上层血浆，放于-80 ℃ 冰箱保存；采用酶联免疫吸附双抗体夹心法测定血浆vWF含量。

1.7 支架血管段组织切片及HE染色 支架术后28 d复查冠脉造影，处死小型猪，分离冠状动脉支架段血管，以4%多聚甲醛加压冲洗管腔并固定。参考Buijs R方法[12]，将标本依次经70%，80%，90%乙醇脱水，100%甲基丙烯酸甲酯包埋，切片机20 μm连续切片，行常规苏木精-伊红（HE）染色观察。

1.8 统计学处理 SPSS 17.0软件包统计学处理，所有数据采用±s表示，组间比较采用方差分析，如方差分析拒绝无效假设，则采用Bonferrni法进行2组间比较，P

2 结果

2.1 人主动脉平滑肌细胞和主动脉成纤维细胞RT-PCR检测 与对照组相比，两药联合组显著上调人平滑肌细胞和成纤维细胞Smad7基因，下调TGF-β1，显著抑制I型胶原基因表达（P

2.2 人主动脉平滑肌细胞和主动脉成纤维细胞ELISA检测 平滑肌细胞中，两药联合组Ⅰ型胶原蛋白表达量略低于雷帕霉素组，但无显著性差异，CDI为0.83；成纤维细胞中，两药联合组Ⅰ型胶原蛋白表达量显著低于雷帕霉素组（P

2.3 小型猪再狭窄模型制备及冠脉造影结果 A，B 2组16只小型猪均顺利完成术前冠脉造影及支架植入，但A组有1例小型猪在术后股动脉缝合过程中，因线结脱落，最终失血性休克死亡，被排除实验。术后28 d，15只小型猪均再次复查冠脉造影，并与术前造影图像对比，观察支架段血管变化，见图1。2组均未见明显支架再狭窄，但A组有3例小型猪，支架管腔边缘模糊，冠脉血流较慢，血流TIMI 3-。

2.4 ELISA法检测血浆vWF A组（n=7）术后第7，14天vWF抗原水平分别为（169.13±5.33）%，（148.82±4.37）%，B组（n=8）术后第7，14天vWF抗原水平分别为（131.26±4.42）%，（112.66±3.67）%。支架术后7，14 d时，B组vWF表达水平均显著低于A组（P

2.5 病理学分析 术后28 d，A，B 2组支架血管段组织切片HE染色见图2，支架段冠状动脉的平均血管面积、支架内面积、管腔面积和新生内膜面积见表4。2组血管面积和支架内面积无统计学差异；B组管腔面积显著大于A组（P

3 讨论

积雪草苷是积雪草中提取的三萜类单分子化合物，广泛应用于皮肤烧伤外科。体外应用cDNA微控阵技术检测积雪草苷对皮肤成纤维细胞的基因表达谱作用，结果发现54种功能基因在不同时间位点显著上调，包括负责细胞增生和细胞外基质合成的特定功能基因[13]。研究发现，积雪草苷可作用于成纤维细胞的细胞核，抑制细胞核分裂，减少细胞内DNA合成，使核仁变小或缺失，细胞生长呈抑制状态，抑制率随用药浓度增大而显著增加，抑制率最高可达73%[14]。同时，积雪草苷还会引起成纤维细胞粗面内质网疏松、内容物减少，白体脱颗粒，显著抑制胶原蛋白合成和分泌，并呈剂量依赖效应[15]。因此，积雪草苷具有阻断成纤维细胞生长增殖，抑制其合成分泌胶原蛋白的作用。有学者通过研究皮肤瘢痕成纤维细胞发现，积雪草苷可以显著上调Smad7的mRNA表达，增加Smad7蛋白合成及向胞质内转移，显著抑制TGF-β1信号，减少Ⅰ型胶原蛋白分泌[10]。但积雪草苷对于血管损伤修复过程中的成纤维细胞和平滑肌细胞是否也存在同样作用机制，目前缺乏相关研究。

PCI术后，血管外膜成纤维细胞会通过伪足向内中膜迁移，并通过表型修饰，转化为分泌性肌成纤维细胞；中膜平滑肌细胞会向内膜迁移，并由收缩型转化为分泌型[16]。表型修饰后的平滑肌细胞和成纤维细胞通过迁移、增殖，大量分泌胶原、蛋白多糖等胞外基质（ECM），约占支架术后再狭窄成分的80%，I型胶原蛋白是其中主要成分，而TGF-β1则是上游调节I型胶原蛋白分泌的关键因子[1-5]。

研究显示，相对于雷帕霉素单一用药组，两药联合组无论在平滑肌细胞还是成纤维细胞中，均能显著下调TGF-β1，进一步抑制I型胶原蛋白表达，虽然在平滑肌细胞中没有达到统计学意义，但CDI 0.83仍提示有较明显的协同作用。雷帕霉素主要针对雷帕霉素靶蛋白，通过PI3K/AKT通路抑制TGF-β1，但TGF-β1同时还受Smads蛋白信号通路调节，而积雪草苷则能通过显著上调Smad7基因，抑制TGF-β1表达，因而具有协同作用，这一点在qRT-PCR实验中也得到证实[10，17]。

血管性血友病因子（vWF）是一种具有黏附功能的大分子糖蛋白，内皮细胞是vWF合成和贮存的主要场所，vWF升高常作为内皮细胞凋亡和内皮细胞功能障碍的标志因子[18]；支架术后24 h即可出现内皮细胞再生，约2周时再生速度达到最大，至6周后内皮修复逐渐减慢，趋于停止[19]。有研究显示，支架再狭窄模型中，猪冠状动脉1个月的改变类似于人类冠状动脉6个月的改变[20]。因此，以28 d作为小型猪再狭窄模型的随访期。

在中华小型猪模型中，由于手术损伤大量内皮细胞，发现支架术后即刻vWF表达水平最高；此后，随着雷帕霉素释放浓度逐渐降低，vWF表达水平也随之下降。但不管在术后7 d内皮细胞再生高峰，还是术后14 d内皮再生速度减缓，B组由于积雪草苷干预，vWF表达水平始终显著低于A组，说明积雪草苷显著减少雷帕霉素导致的内皮细胞损伤，其机制可能与抗氧化作用有关[9]。

小型猪术后28 d复查冠脉造影，与支架术后即刻造影相比，2组冠脉支架植入处均未见明显狭窄，但A组有3例小型猪支架管腔边缘模糊，冠脉血流TIMI 3-。由于术前采用球囊大压力预扩，来回牵拉，并且支架过度释放，所以对于血管内膜的损伤要远远大于正常PCI手术。A组小型猪边缘模糊可能与内中膜增生有关，而冠脉血流减慢则可能是由于内皮细胞大量受损，炎性反应激活，抑制内皮细胞对NO等相关因子释放，导致血管收缩和舒张活动减弱所致。2组小型猪模型的血管面积和支架内面积无统计学差异；但B组管腔面积显著大于A组（P

本研究存在一定局限，小型猪冠状动脉术前并无粥样硬化，且动物实验的样本量较小，随访时间偏短，这些可能一定程度上影响统计学结果。在接下来的研究中，将扩大样本量至30头小型猪，延长随访时间至6～12个月，以进一步观察积雪草苷在防治支架再狭窄过程中的生化调节作用。

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Biochemical regulatory mechanism of asiaticoside in preventing and

treating stent restenosis

HOU Shi-qiang， FANG Ming， CHEN Sha-sha， CONG Xin-peng， ZHANG Da-dong， LI Xin-ming

（1.Medical College， Tongji University， Shanghai 200092， China；

2.Department of Cardiology， Central Hospital of Minhang， Shanghai 201199， China；

3.Department of Cardiology， Shanghai Pudong New Area Zhoupu Hospital， Shanghai 201318， China）

[Abstract] Objective： To discuss whether asiaticosides could effectively reduce the endothelial cell damage as a biochemical modulator， so as to further inhibit the post-stenting intima-media membrane hyperplasia. Method： Human aortic smooth muscle cells and aortic fibroblasts were selected and divided into the blank group， the rapamycin group and the asiaticoside group and the rapamycin and asiaticoside group. The expressions of muscle cells and fibroblasts TGF-β1， Smad7 and I-collagen gene were determined by RT-PCR. The expression quantity of I-collagen protein was assayed by ELISA. The coefficient of drug interaction （CDI） between rapamycin and asiaticoside was calculated. Additionally， 16 Chinese mini-swines were randomly divided into group A and group B. One sirolimus drug-eluting stent of the same type was implanted after the high-pressure pre-expansion of anterior descending artery balloon. After the operation， the group A was intravenously injected with normal saline 30 mL·d-1. Whereas the group B was intravenously injected with asiaticoside 30 mg·kg-1·d-1 （diluted to 30 mL）. The expressions of plasma vWF of the two groups were measured at the 7th and 14th days after the operation. At the 28th day after the operation， tissues of the stented vessel segments were sliced and stained to calculate the vessel area， inner stent area， lumen area and neointima area. Result： Compared with the control group， the combination group showed significant up-regulation in smooth muscle cells and fibroblast Smad7 gene， down-regulation in TGF-β1， and obvious inhibition of I-collagen gene expression（P

[Key words] asiaticoside； rapamycin； Smad7； biochemical modulator

doi：10.4268/cjcmm20140823