Wnt信号激活剂氯化锂抑制脂肪细胞分化的研究

【摘要】目的证实Wnt信号激活剂（氯化锂）可以抑制骨髓基质干细胞（BMSCs）向脂肪细胞分化的作用。方法体外培养Balb/c小鼠骨髓基质细胞并诱导其向脂肪细胞分化，再用Wnt信号激活剂氯化锂干预，用油红O染色观察脂肪细胞的形成，RT-PCR检测骨髓基质细胞中脂肪细胞PPAR-γ和成骨细胞Runx-2相关基因的表达。结论Wnt信号激活剂氯化锂可以抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化。

【关键词】Wnt信号激活剂；氯化锂；基质干细胞

062文章编号：1004-7484（2014）-06-3056-02

有研究证实Wnt信号可以抑制基质干细胞向脂肪细胞分化，促进其向成骨细胞分化。经典Wnt信号通路是Wnt蛋白可以结合Frizzled受体家族。这些受体的活化使通路中的关键蛋白β-连环蛋白（β-catenin）在胞浆中稳定并累积，然后进入胞核与TCF/Lef转录因子结合，从而诱导Wnt靶基因的转录。通常，在没有Wnt信号的情况下，β-catenin不断地被降解复合物（APC/Axin/GSK-3β）中的GSK-3β在其氨基末端磷酸化，从而被蛋白酶降解。这样，可以通过抑制GSK-3β使β-catenin在胞浆中积聚从而间接达到Wnt信号活化效应。所以本试验选择了GSK-3β的抑制剂氯化锂（LiCl）来进行研究。又因为再障是一种器官特异性的自身免疫性疾病，环孢素A作为非细胞特异性的免疫抑制剂，是临床治疗再障的基本药物。该实验为氯化锂联合环孢素A治疗再障提供理论基础，以达到更好的临床治疗效果。

1资料与方法

1.1一般资料动物：雌性Balb/c小鼠（H-2d）8-12周龄，18-22克，由武汉大学实验动物中心提供。

1.2药品及试剂氯化锂、地塞米松、胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）均购自美国Sigma公司，胰酶粉剂、油红O购自美国Amerisco公司，标准胎牛血清为杭州四季青公司产品，RT-PCR试剂、TRIzol试剂购自TaKaRa公司。L-DMEM培养基为美国HyClone-Pierce公司产品。

1.3试剂配制油红O染液的配制：油红O干粉0.4g加入10mL异丙醇充分溶解，干液室温保存。干液和三蒸水以3：2比例混合，过滤、取滤液作为新鲜染液。脂肪细胞分化培养基1：10ml胎牛血清、1mg胰岛素、0.1μmol地塞米松、0.05mmolIBMX、90mlL-DMEM。脂肪细胞分化培养基2：10ml胎牛血清、1mg胰岛素、90mlL-DMEM。红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）：NH4Cl3.735g加上450ml双蒸水，Tris碱1.0297g加上50ml双蒸水，两者混匀，过滤除菌，待用。

1.4方法

1.4.1正常小鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）的培养正常小鼠拉颈处死，无菌取下股骨和胫骨，机械分离血管结缔组织，PBS冲洗，用针头在生长端打孔，注射器将骨髓细胞吹入无血清DMEM培养基中并反复吸冲成单细胞悬液，离心1500r/min×10min。细胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬后以20×107/瓶密度接种于100cm2培养瓶中。72h后首次半量换液，以后每3-4天换液一次。11d左右BMSCs约80%汇合，室温条件下用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA按1：1混合消化分离细胞并传代。

1.4.2定向诱导BMSCs向脂肪细胞分化第二继代细胞以每毫升5×104个接种于6个培养皿中，分为对照组，脂肪细胞组和Licl抑制组。细胞达到80%汇合后对照组继续加常规培养液，脂肪细胞组换成脂肪细胞分化培养基1，Licl抑制组换为脂肪细胞分化培养基1并加入LiCl使其终浓度为20mmol/L。两天后换液，对照组继续加常规培养液，脂肪细胞组换为脂肪细胞分化培养基2，Licl抑制组换为脂肪细胞分化培养基2再加LiCl使其终浓度为20mmol/L。两天后，均换为常规培养液。于培养的第14天将各组细胞做油红O染色，并取各组细胞约107个，各加入1mlTRIzol用于做RT-PCR。

1.4.3脂肪细胞的检测每日通过倒置显微镜观察诱导分化的细胞，待分化后的脂肪细胞中脂肪颗粒较多较大时，即大约诱导分化的第14天左右，用油红O染色，检测脂肪细胞的数量，具体方法为：各组细胞用PBS冲洗3次，10%中性甲醛固定10min，油红O染液浸染10min，60%异丙醇洗去多余染液，PBS冲洗3次，苏木精复染3-5min，1%盐酸稍分化，PBS漂洗10min，显微镜下观察。

1.4.4RT-PCR检测PPAR-γ和Runx-2的半定量表达将各组细胞中的培养液倒掉，各加入1mlTRIzol，吹打混匀后，各移入1.5ml的Eppendorf管中，按照说明书步骤提取RNA，然后在PCR仪上逆转录，再进行PCR扩增，所用引物序列为PPAR-γ上游5’-3’aagagctgacccaatggttg，下游5’-3’ggatccggcagttaagatca，产物长度296；Runx-2上游5’-3’ggacgaggcaagagtttca下游5’-3’ggtggcagtgtcatcatctg，产物长度465bp，扩增条件：95℃变性5分钟；94℃变性30秒，58℃复性45秒，72℃延伸45秒，30个循环；72℃保温10分钟。扩增后在琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中观察条带的深浅。

2结果

2.1正常小鼠骨髓基质干细胞诱导脂肪细胞组BMSCs培养向脂肪细胞分化的第7天细胞中已开始出现脂肪小滴，随后几天脂肪滴逐渐增多，并相互融合，在诱导的第14天做油红O染色，已形成脂肪细胞，如图1右所示；而加入LiCl（抑制组）的基质干细胞却没有向脂肪细胞分化，生长如正常基质细胞，如图1左所示。

2.2各组细胞RT-PCR检测PPAR-γ和Runx-2基因表达的结果脂肪细胞组的细胞表达PPAR-γ比Licl抑制组强，而Licl抑制组表达Runx-2比脂肪细胞组强。这就证实了LiCl确实能抑制基质干细胞向脂肪细胞分化（见图2）。

3讨论

3.1间充质干细胞（mesenchymal stem cell）为中胚层发育的早期细胞具有全能干细胞的特点，能进行多向分化，目前主要来源为骨髓。国内外已有大量的实验证实骨髓MSCs能分化为造血基质，支持造血，还可向中胚层和外胚层来源的组织分化。目前认为最有效的认定是分离的细胞能被定向诱导分化为多种间充质来源的组织细胞，即定向诱导分化为骨、脂肪、软骨细胞是判定MSCs的标志。所以我们的试验未通过分离细胞而是直接向贴壁的细胞中加入脂肪细胞分化液，通过细胞培养分化最终证实MSCs可以向脂肪细胞分化。而加入氯化锂的细胞抑制组未见有脂肪细胞形成，且RT-PCR实验结果证实脂肪细胞的相关基因PPAR-γ在加入氯化锂后表达明显减弱，这些结果充分证实了Wnt信号可以抑制基质干细胞向脂肪细胞分化，促进其向成骨细胞分化。这也为环孢素A联合氯化锂治疗再生障碍性贫血提供了理论基础。

3.2Wnt信号与骨髓造血和骨髓基质干细胞的作用在造血系统中，造血干细胞（HSC）及骨髓基质干细胞均表达Wnt蛋白。Wnt信号途径被认为在维持HSC自我更新方面有一定作用。转导β―catenin可使HSC增殖并维持其表型，阻断Wnt信号途径可使HSC的体外增殖及体内造血重建能力降低，纯化的Wnt蛋白则能抑制HSC分化并增加其造血能力。此外，Wnt信号能抑制骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化，促进其向成骨细胞分化。而成骨细胞对骨髓的造血有重要作用。该实验采用Wnt信号激活剂（氯化锂）证实了这个结论。

图2 第1、2泳道为内参β-actin，可见抑制组细胞和脂肪细胞组细胞的RNA提取和逆转录很成功；3泳道为加入LiCl的抑制组细胞逆转录扩增PPAR-γ基因，4泳道为脂肪细胞诱导组细胞逆转录扩增PPAR-γ基因，可明显看出抑制组的PPAR-γ基因表达明显减低；5泳道为加入LiCl的抑制组细胞逆转录扩增Runx-2基因，6泳道为脂肪细胞诱导组细胞逆转录扩增Runx-2基因，可看出抑制组的Runx-2基因表达明显增强。

参考文献

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