骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中Wnt信号通路的作用研究

摘 要：骨髓间充质干细胞（bone marrow-derved mesenchymal stem cells，BM-MSCs）具有多向分化潜能，可以应用于修复细胞、组织、器官的损伤，通过干细胞移植疗法治疗多种疾病。BM-MSCs在一定的条件下可以诱导产生心肌细胞（cardiomyocytes，CMs），为治疗心血管疾病带来了希望。在心脏的分化过程中，Wnt信号通路发挥着非常重要的作用，因此对BM-MSCs分化为CMs过程中Wnt信号通路所发挥的作用做一简述。

关键词：骨髓间充质干细胞；心肌细胞；Wnt信号通路

中图分类号：Q782

文献标识码：A

文章编号：1007 7847（20l4）06-0539-04

心血管疾病发病率高，危害性大，是当今威胁人类健康最重要的疾病。所有的心肌疾病，特别是心肌梗死会导致心肌细胞（CMs）的死亡，进而引起心脏衰竭。CMs 一旦死亡就无法再生，而BM-MSCs是一种具有自我更新、增殖和定向分化为中胚层、内胚层、神经外胚层来源的多潜能干细胞，可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞等，可以应用于修复细胞、组织、器官的损伤，将BM-MSCs作为CMs的来源，为CMs再生的发展带来了新的希望。Wnt信号通路参与心脏分化过程，并发挥着非常重要的调节作用，因此以下就主要探讨BM-MSCs分化为CMs过程中Wnt信号通路所发挥的作用。

1 BM-MSCs向CMs分化及应用

随着心血管疾病的发病率逐年增加，运用BM -MSCs，治疗心血管疾病日益受到人们的广泛关注。Nadia等分别用5-氮杂胞苷（5 -azacyti-dine， 5-aza）和zebularine在体外诱导BM-MSCs并与CMs以2：1的比例共同培养，经过15 d的培养，经处理过的BM-MSCs分化出类似CMs形态的细胞，在相邻细胞间形成肌管样结构，并表达心肌特异性基因GATA4和Nkx2.5，以及心肌特异性蛋白肌钙蛋白T （cardiac troponin T，cTnt），证明经5 -aza和zebularine处理过的BM-MSCs可分化出心肌样细胞。

Nagaya等将用红色荧光染料PKH26标记的BM-MSCs注射到扩张型心肌病大鼠的心肌中，移植后的BM-MSCs可表达心肌特异性标志物cTnT，结蛋白，连接蛋白-43，并且移植BM-MSCs后明显增加了毛细血管密度，并降低左心室舒张末期压力，增加等容收缩期左心室内压力上升的最大速率，从而改善扩张型心肌病大鼠的心功能。用流式细胞仪分析离体的心脏细胞，仅有（8±l）%的BM -MSCs表现为PKH26和cTnT双阳性，表明移植后的BM-MSCs仅有少数可以分化CMs。此外，Wang等通过结扎21只SD大鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，结扎一周后，18只大鼠作为实验组直接用PKH26标记的BM-MSCs的磷酸盐缓冲液注射到梗死的心肌，3只大鼠只接受磷酸盐缓冲液，另3只未结扎的大鼠作为对照组，培养6周后，在注射BM-MSCs的大鼠可观察到PKH26标记的跳动的心肌样细胞，收缩力与正常CMs相同，射血分数随着培养时间的延长而增加。

2 Wnt信号通路

Wnt家族可调节胚胎发育的许多不同的方面，在哺乳动物基因组中存在19个Wnt基因。Wnt蛋白是果蝇无翅基凶的同源物，富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白。Wnt信号通路可以调节细胞行为，包括细胞的生长、增殖、分化、迁移、凋亡和细胞的极性等。目前Wnt信号通路至少有4种信号通路：经典Wnt通路（wnt/β-连环蛋白（β-catenin）通路）、Wnt/Ca2+信号通路、Wnt/PCP （planarcell polarity，PCP）信号通路、调节纺锤体定向和不对称绌胞分裂的通路。

2.1 经典Wnt信号通路

经典Wnt通路的关键步骤就是β-Catenin在细胞质内的水平。在无Wnt信号刺激时，β-catenin一方面可以与结肠腺瘤样息肉基因编码的蛋白（adenomatous polyposis coli， APC）、轴蛋白（Axin）、糖原合成酶激酶-3 （glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、酪蛋白激酶 I（casein kinase 1.CKl）和E3泛素连接酶β-TRCP形成复合物，GJSK-3促进β-catenin磷酸化，继而被β-TRCP识别泛素化降解，蛋白磷酸酶2A （protein phosphatase 2A，PP2A）可抑制复合物的形成和β-catenin的降解。另一方面大量的β-catenin与 E-钙粘蛋白（E-cad―herin）形成复合物稳定在细胞膜上，作为一种肌动蛋白细胞骨架的结构蛋白，并介导细胞与细胞之间的黏附。当Wnt信号存在时，通常由Wntl、Wnt2a、Wnt3a、Wnt8a等激活，经典Wnt信号通路通过Wnt蛋白结合卷曲蛋白（frizzled， FZD）家族的受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5 （low den-sity lipoprotein receptor-related protein 5.LRP5）或LRP6受体激活细胞内的Wnt/β-catenin信号通路。Wnt-FZD-LRP6形成的复合物与被激活的具有支架蛋白作用的散乱蛋白 （dishevelled， DVL）使LRP6磷酸化并使Axin介导的β-catenin磷酸化受到抑制，从而使β-catenin在细胞质内聚集并向细胞核转移，在细胞核内与T细胞因子/淋巴增强因子（T-cell factor/Lymphoid enhancing factor，TCF/LEF）结合形成复合物并激活Wnt靶基因的表达。Wnt信号通路具体过程见图l。当细胞核内缺乏β-catenin时，TCF可以与转录辅阻遏物C一终端一结合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）结合，从而抑制Wnt信号。同时Gro通过与β-catenin重叠的结合位点使转录抑制。

2.2 WnUCa2+信号通路

当Wnt4、Wnt5a、Wntll激活Wnt/Ca2+信号通路，Wnt蛋白可以与FZD结合通过G蛋白激活磷脂酶C （phospholipase C，PLC）生成二酰甘油（dia-cylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol trisphos-phate，IP3），DAG和IP3使内质网膜上的钙离子通道开放释放钙离子，从而增加细胞内的Ca2+浓度增加。同时Wnt/FZD也町激活磷酸二酯酶6（phosphodiesterases6，PDE6）水解环磷酸鸟苷（cycliC guanosine monopllosphate， cGMP），从而消耗细胞内的cGMP，使细胞内的Caz+浓度增加。随着钙离子浓度的增加，钙调蛋白大量表达激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/calmodulin-de-pendent protein kinase 2，CaMKⅡ）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），因而激活各种调节蛋白而发挥作用。

2.3 WnUPCP信号通路

Wnt/PCP信号通路是通过激活RhoA、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和nemo 样激酶（nemo-like kinase， NLK）引发的信号级联反应。人类PCP的核心信号分子是VAN-GL1、VANGL2、CELSRl、CELSR2、CELSR3、DVL1、DVL2、DVL3、PRICKLEl、PRICKLE2和ANKRD6。在脊椎动物中，Wnt/PCP信号通路由非经典的Wnt5a、Wnt5b、Wnt11介导，而不是通过β-catenin介导，非经典的Wnt信号与FZD受体结合并激活细胞质骨架蛋白DVL和三聚体G蛋白，DVL、散乱蛋白相关形态形成活化因子-l（disllevelled as-sociatied activator of morphogenesis-1， Daaml）、RhoA形成复合物激活RhoA蛋白，从而导致Rock激酶活化和MRLC磷酸化。DVL与Rac1形成的复合物可激活JNK来发挥作用。

2.4 调节纺锤体定向和不对称细胞分裂的通路

目前对于调节纺锤体定向和不对称细胞分裂的通路研究棚对较少。Wnt信号通路的一些分子如GSK-β，APC参与某些牛物如果蝇和线虫细胞分裂过程中纺锤体方向的确定和非对称细胞分裂。

3 Wnt信号通路与CMs分化的关系

在瓜蟾原肠胚形成过程中早期短暂激活经典Wnt信号通路对心脏发牛没有产生影响，但持续激活或在原肠胚形成之后该途径可抑制CMs分化。为研究经典Wnt信号通路对于哺乳动物CMs的分化作用，Naito等将小鼠胚胎干细胞（embryon-ic stem cell， ES）作为实验对象，研究发现早期拟胚体（embryoid body，EB）阶段通过经典Wnt信号通路促进EB细胞分化为CMs，而在中后期，经典Wnt信号通路抑制CMs分化。在人类中，在早期需要激活经典Wnt信号通路促进间充质细胞向CMs分化，而在后期下调β-catenin抑制经典Wnt信号通路有利于心脏重塑。因此在CMs分化过程中，经典Wnt信号通路具有双向调节作用，在早期发挥促进作用，在中后期发挥抑制作用。

最近研究证实Wnt5a和Wnt11通过抵制经典Wnt信号通路下调β-catein，共同促进ES向心肌祖细胞分化，是心脏形成和发育过程中不可或缺的一部分，若Wnt5a和Wnt11缺失，可使经典Wnt信号通路激活，心脏发育受到严重损害。此外Wnt2通过非经典Wnt信号通路而激活经典Wnt信号通路促进小鼠ES分化为CMs，去除Wnt2抑制 ES向CMs的分化，加入外源性Wnt2可以纠正，但是加入的时间受到限制。所以非经典Wnt信号通路通过抑制经典Wnt信号通路促进CMs分化。

4 Wnt信号通路在BM -MSCs分化为CMs的作用

4.1 Wnt信号通路与BM-MSCs增殖的关系

Karow等不同浓度的Wnt3a转导人鼠BM -MSCs，促进细胞质内β一catenin积累，使β-catenin向细胞核内迁移激活经典Wnt信号通路，使与BM-MSCs增殖密切相关的Wnt11目的基因cyclin Dl得以表达，进而促进BM-MSCs增殖，实验发现最佳的Wnt3a浓度为150 ng/mL。若将siRNAs（可拮抗β-catenin）导入BM-MSCs，与未导入SiRNAs的对照组相比，使β-catenin和cyclin DlmRNA的表达明显降低。同样在人BM-MSCs中，Wnt3a可以促进BM-MSCs的增殖，并|且可以增强BM-MSCs的迁移和侵袭能力，如果加入干扰β-catenin和LRP5的RNA或去除β-catenin或LRP5，均能使目的基因cyclin Dl转录受损，使BM-MSCs增殖能力和侵袭能力显著减弱。与此同时为了评估经Wnt3a处理未分化的RM-MSCs是否保持着祖细胞的特性和功能，诱导获得的BM-MSCs向成骨细胞和脂肪细胞分化，这些细胞仍显示Ca2+沉积或细胞内脂肪空泡的堆积，说明Wnt3a不影响BM-MSCs的细胞特性和功能。所以Wnt3a通过激活经典Wnt信号通路促进BM-MSCs增殖，增强BM-MSCs的迁移和侵袭能力，同时保持着BM-MSCs多向分化能力。

4.2 Wnt信号通路与BM -MSCs分化为CMs的关系

He等在研究转导Wntll是否能直接增加BM-MSCs分化为心肌表型的实验中，实验组将Wnt11和绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）转导入BM-MSCs，对照组只将GFP转导入BM -MSCs，为了鉴定细胞融合情况，将两组的BM-MSCs以1：40的比例与刚出生1―3d的SD大鼠CMs混合培养7 d，结果实验组心肌特异性基因表达产物GATA-4、脑尿钠肽（brain naLriuret-ic peptide，BNP）、islet-l和α-肌动蛋白（α-actin）高于对照组，并且在BM-MSCs与被PKH26标记的CMs之间发现了连接蛋白-43。 Wntll大量表达显著提高了BM-MSCs心肌标志物的表达，并在共培养过程中促进了BM-MSCs分化为心肌细胞表型。

在此基础上，Zuo等展开了导入Wnt11的BM-MSCs是否可改善急性心肌缺血的研究，将实验分为5组，假手术控制组和4组急性心肌梗死大鼠接受不同的治疗：在缺血的心肌边缘分别注射50μL的培养基，50μL含l.5x10 6个细胞的MSCWnt11 （将Wntll和GFP导入BM -MSCs），MSCNull（将GFP导入BM-MSCs）和MSCbas（未经任何转导）。实验结果显示在缺血的心肌中，Wnt11显著增加了BM-MSCs在缺血心肌中的存活率，相比于其他组MSCWnt11组左心室缩短分数和射血分数明显改善，Masson三色染色和TUNEL染色显示MSCWntll组心肌梗死面积和细胞凋亡明显减少，说明心脏功能的改善与MSCWnt11注射人心肌成正相关。

相关研究均支持这一结论，Wnt11能抑制经典Wnt信号通路，激活非经典Wnt信号通路促进BM-MSCs向CMs分化。

5 展望

在当今社会，心血管疾病不仅给社会和家庭带来了严重的经济负担，而且也严重危害了个人的身体健康。一直以来研究人员都在寻求治疗心血管疾病的最佳方法，可以改善心血管功能，防治心血管疾病。BM-MSCs取材方便，在体外培养操作简单方便，并且具有多向分化潜能，有很大的可塑性和治疗应用潜力，为治疗心血管疾病带来了希望。研究BM-MSCs分化为CMs过程中的Wnt信号通路，为BM-MSCs应用于治疗心血管疾病打下坚实的基础，在不久的将来，BM-MSCs定会在心血管领域有新的突破。