TLC结合HPLC法检测保健食品及中成药中掺加化学降糖药物的研究

文章编号：1008-6919（2007）09-0148-03 中图分类号:R284 文献标识码：A 【医药管理】

【摘要】 目的 建立一种检测保健食品及中成药中非法掺加化学降糖药物的筛查方法。 方法采用TLC法对保健食品和中成药非法掺加化学降糖药物进行初步定性，然后用HPLC法进行定性定量分析。结果 本实验建立的条件能够把保健食品及中药制剂中添加的降糖化学药物（格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲）同时完全分离开来；对18种制剂用建立的分析技术进行了检测，经与相应的标准物质比较，得到有 8种保健食品和中成药中非法掺有降糖化学药品，1种食品中非法掺入了降糖化学药品。结论 该研究建立的方法具有快速、简便、重复性好、便于操作、灵敏、专属性强等优点。

关键词：TLC HPLC 保健食品 中成药 化学降糖药物

我国食品和药品市场上出现了在降糖保健食品和中成药添加格列本脲、格列齐特等化学药，面对此类的违法行为，光凭肉眼很难识别，必须通过现代先进技术的检测才能识别，现有单一的薄层色谱法、紫外分光光度法或HPLC法，已很难满足检测的要求，尤其是干扰成分多且量少的情况。虽然现有HPLC-MS法可以解决此类问题，但仪器太昂贵，基层单位很难拥有，故本文作者根据实际需要，建立了TLC结合HPLC法这种专属性强、灵敏度高且基层适用的检测技术，有很大的实际应用意义。

1 仪器与试药

1.1试药

格列本脲对照品（批号：10135-200404），格列齐特对照品（批号：0269-9701），格列吡嗪对照品（批号：100281-0001），格列喹酮对照品（批号：100280-200301），格列美脲对照品（批号：100674-200301）。以上均购自中国药品生物制品检定所。

降糖中成药制剂S1，S2，S3，S4，S5、S6，S7 、S8、S9、S10。降糖食品S11，S12，S13，S14，S15、S16，S17 、S18。以上样品均为市售品。

甲醇（色谱纯 ）,乙腈（色谱纯 ）,乙酸铵、石油醚（60～90℃）、无水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷，均为分析纯，硅胶GF254预制板（200×200mm，青岛海浪硅胶干燥剂厂，批号20061012）

1.2仪器Waters高效液相色谱仪，Empower色谱工作站，ThermoTM C18柱（250mm×4.6mm,5μm）。ZF-I型三用紫外分析仪，TLC SCANNER3薄层色谱扫描仪（瑞士CAMANG公司）。

2 实验方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1对照品溶液的配制分别精密称取格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲对照品各约5 mg，加三氯甲烷5 ml使其溶解，备用。

2.1.2样品溶液的配制分别取各样品的一次口服剂量，研细，分别置100 ml锥型瓶中，各加三氯甲烷30 ml，超声30分钟，滤过，蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使其溶解，备用。

2.1.3 薄层板：硅胶GF254预制板（200×200mm，青岛海浪硅胶干燥剂厂，批号20061012，厚0.3mm）临用前110 ℃活化30分钟。

2.1.4点样量：取上述溶液各5μl。

2.1.5展开剂：石油醚-乙酸乙酯-三氯甲烷-无水乙醇-甲酸（10：5：2：1：0.1）。

2.1.6展开方式：预饱和15分钟，上行展开，展距：18cm，温度：：22 ℃, 相对湿度：75%。

2.2结果

2.2.1薄层检识结果 取出，晾干，置紫外灯254nm下，检识，得到保健食品S12和中成药S6，S8的色谱图中在与格列本脲和格列齐特对照品相应的位置上显相同的斑点；保健食品S17的色谱图中在与格列美脲和格列齐特对照品相应的位置上显相同的斑点；保健食品S13，S15、S18和中成药S5，S7的色谱图中在与格列本脲对照品相应的位置上显相同的斑点，具体图谱见图1。

图1 （从左到右编号） 1-格列本脲对照品 2-格列吡嗪对照品 3-格列喹酮对照品 4-格列美脲对照品 5-格列齐特对照品6,7-混合对照品8-样品S13 9-样品S15 10-样品S18 11-样品S1712-样品S12 13-样品S6 14-样品S8

Fig 1 1- Glibenclamide,2- Glipizide3- Gliquidone4- Glimepiride5- Gliclazide 6,7-the mixture 8- the sample S13 9- the sample S1510- the sample S1311- the sample S1712- the sample S12 13- the sample S6 14- the sample S8

2.2.2薄层扫描结果取上述薄层板在薄层扫描仪上扫描得到图谱，结果与上述一致，具体图谱见图2。

图2 A ：格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列吡嗪、格列美脲混合对照品的TLC扫描图

B：阴性样本食品S11的TLC扫描图C：中成药S8的TLC扫描图D：食品S17的TLC扫描图

Fig 2A ：Chromatograms of Glibenclamide,Gliclazide,Glipizide,Gliquidone,Glimepiride

B ：Chromatograms ofthe blank C：Chromatograms ofthe sample D: Chromatograms ofthe food

3 HPLC法的定量测定

3.1 对照品溶液的配制分别精密称取格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲对照品各约25 mg，分置50 ml的容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

3.2样品溶液的配制

3.2.1 样品溶液的配制分别取样品各10粒（片），精密称定，取内容物粉末[约相当于1粒（片）]分别置25 ml容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，备用。

3.2.2阴性溶液的配制取阴性样品10粒，精密称定，取内容物粉末（约相当于1粒）置25 ml容量瓶中，加甲醇使其溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，备用。

3.3色谱条件采用Thermo C18柱（5 μm,250 mm×4.6 mm）, 柱温：30 ℃,

流动相：乙腈-20 mmoL・ L-1乙酸铵溶液（+0.1%乙酸）,梯度洗脱程序为：（40:60～50:50, 0～5 min ）,(50:50～55:45,5～15min),(55:45～50:50,15～40min),(50:50～40:60，40～60 min),流速：1.0 ml・min -1, 检测波长：235 nm,进样量：20μl。

3.4最佳实验条件的选择

3.4.1检测波长的选择取上述各对照品母液加甲醇稀释成约10μg・ml-1的溶液，在190 nm～370 nm的波长范围内进行扫描，测得格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列吡嗪的最大吸收波长为235 nm左右。故本实验选择235 nm作为检测波长，以便同时测定上述5种药物。

3.4.2流动相的选择根据文献报道，分别配制了5 mmoL・L-1庚烷磺酸钠溶液-乙腈、5 mmoL・L-1四丁基溴化铵溶液-乙腈、50 mmoL・L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈、20mmoL・L-1乙酸铵溶液（+0.1%乙酸）-乙腈、20mmoL・L-1枸橼酸盐缓冲液－乙腈、20mmoL・L-1乙酸胺溶液-0.1%的乙酸－乙腈、0.5%醋酸－乙腈、0.5%醋酸－乙醇－乙腈，在本研究中考察了上述流动相对各物质色谱行为的影响，发现5 mmoL・L-1庚烷磺酸钠溶液-乙腈、5 mmoL・L-1四丁基溴化铵溶液-乙腈分别作为流动相时，其色谱峰拖尾，有很多杂质峰，且在室温低的时候容易出现浑浊；50 mmoL・L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈、30 mmoL・L-1醋酸铵溶液-乙腈分别作为流动相时，各物质色谱峰峰形好，且能够完全分离开来，但为了保护柱子，因有磷酸盐的流动相，故选择20 mmoL・L-1乙酸铵溶液（+0.1%乙酸）-乙腈作为流动相。

3.4.3 流速的影响 考察了0.8 ,1.0 ,1.2ml・min -1三个流速，流速太小，出峰时间长且拖尾严重，色谱峰扩宽；流速太大，各组分保留时间均减小，导致峰分离不好，尤其是替硝唑和塞克硝唑分离不好，故本研究选用出峰时间和峰形较理想的流速为1.0ml・min -1。

3.4.4柱温的影响 考察了20,30,40,50 ℃四种温度，温度越高，出峰越快，且柱效高，但高于30℃后变化不明显，但温度太高对色谱柱不利，故本研究柱温设定为30 ℃。

3.5 实验结果

3.5.1 HPLC色谱分离情况取上述各对照品母液加甲醇分别配制成约20μg・ml -1的溶液及其混合液浓度为20 μg・ml -1，依选定的色谱条件，上机进行分析，记录色谱图，在选择好的实验条件下，格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲5种药物与干扰完全分开，且峰形良好，其保留时间（tR）分别为：24.8 min，16.9min，12.1min，37.7min，26.7min。具体色谱图见图3。

图3A ：格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列吡嗪、格列美脲混合对照品的HPLC图

B ：中成药糖胶囊S5的HPLC图 C ：阴性样品S1的HPLC图D:食品样品S12的HPLC图

Fig 3A ：Chromatograms of Glibenclamide,Gliclazide,Glipizide,Gliquidone,Glimepiride

B ：Chromatograms ofthe sampleC :Chromatograms ofthe blankD: Chromatograms ofthe food

3.5.2标准曲线的制备分别精密量取上述对照品溶液各1.0ml,2.0ml,3.0ml,4.0ml,5.0ml分置50ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按上述选择好的色谱条件进样，记录色谱图，以峰面积（A）对浓度（C）进行线性拟合，得到格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲的回归方程分别为： A格列本脲= 1.11×105 C－3.85×105，r=0.9993，（n=3）;A格列齐特= 0.71×105 C－5.15×105，r=0.9998，（n=3）; A格列吡嗪= 0.90×105C－2.90×105，r=0.9993，（n=3）; A格列喹酮= 9.38×104 C+0.66×104，r=0.9993，（n=3）; A格列美脲= 7.18×104 C+0.72×104，r=0.9995，（n=3）;线性范围分别为：12.50～62.50μg・ml -1，8.40～42.00 μg・ml -1，13.28～66.40μg・ ml -1，9..96～49.80 μg・ml -1， 8.96～44.80 μg・ml -1。

3.5.3 最低检测限的确定根据检出限（S/N≥3）定义为产生相应于三倍背景噪音的标准差分析信号的分析物浓度值。据此定义计算出格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲的检出限分别为0.160 ，0.641 ，0.071，0.085，0.102μg。

3.5.4精密度考察 取标准曲线项下浓度为30 μg・ml -1的对照品溶液进样分析，每天处理5份数据，连续做3 d，求得其日内日间的RSD，具体见表1。

3.5.5重复性试验取标准曲线项下浓度约为30μg・ml -1的对照品溶液连续进样5次，记录色谱图，其峰面积的相对标准偏差RSD分别为1.9%，2.1%，2.9%，1.1%、1.2%。

3.5.6 回收率实验精密量取上述配制好的阴性中成药胶囊S4溶液3 ml置50 ml容量瓶中，再精密加入上述配制好的对照品溶液各2.0 ,3.0 ,4.0 ml分置上述50 ml容量瓶中（各平行试验5份），加甲醇稀释至刻度，摇匀，按标准曲线项下操作，代入标准曲线方程求出各自的回收率，具体见表2。

3.5.7样品测定结果采用上述选择好的色谱条件，取配制好的对照品溶液和样品溶液上机进行分析，记录色谱图，根据外标法，求出其含量，结果见表3。

4 讨论

4.1 采用三氯甲烷作为溶剂时，提取较完全且干扰物质少。

4.2选择石油醚-乙酸乙酯-氯仿-无水乙醇-甲酸（10：5：2：1：0.1）为最佳展开剂。

4.3HPLC法试验中样品提取的溶剂的选择，分别采用了甲醇、氯仿、乙酸乙酯、甲醇－氯仿（1：1），通过实验得到，当溶剂采用甲醇时，其萃取率最好（95%）且峰型最好，故选用甲醇作为溶剂。

4.4 本试验建立的实验条件可以把格列本脲、格列齐特、格列吡嗪、格列喹酮、格列美脲在同一色谱条件下同时完全分离开来，为检测中成药中是否非法加入这5种化学药品，奠定了技术基础，为保障人们的用药安全，将会有很大的实际应用意义。同时对本试验检测所得的阳性样本用HPLC-MS进行了验证实验，结果液相色谱法和用质谱法检测的结果一致，说明该法具有良好的准确性。

参考文献

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