浸矿微生物紫外诱变选育及其浸矿机理初探

摘要：通过转代培养获得活性较高的浸矿细菌，再驯化获得可以浸出铜离子的微生物，通过测量得知普通的浸矿微生物浸矿效率为53.25%。利用紫外线对氧化亚铁硫杆菌进行诱变后, 对黄铜矿进行浸出试验，测得诱变后铜离子的浸出效率提高到92.52%，说明紫外线对浸矿微生物的诱变具有很好的应用前景。

关键词：浸矿微生物；紫外诱变；浸矿机理

中图分类号：Q93 文献标识码：A

1引言

微生物浸矿是指利用某些特殊微生物的代谢活动或代谢产物从矿物或其它物料中浸取金属的过程，是综合了湿法冶金、矿物加工、化学工程、环境工程和微生物学的多学科交叉领域，其研究和应用范围涵盖铜、浸、铀、钴、镍等金属硫化矿的浸出[1]。微生物浸矿最突出的特点就是可以经济合理地处理低品位矿石，甚至可以处理表外矿石、残矿、尾矿和废石，因此对有效开发低品位矿产资源、资源的综合利用等具有重要意义，美国采用生物浸出技术处理的铜矿石品位低至0.04%，此外，生物浸矿技术具有良好的环境价值[2]。

当前所采用的菌大都从自然界分离驯化，存在浸矿周期长、生长速度慢、氧化能力弱、适应力差等问题[3]。诱变育种通过人为使其遗传物质发生变异，从而大大缩短选育高产菌株所需要的时间。而紫外线诱变育种的原理是紫外线照射能使DNA分子形成嗜咤二聚体，阻碍碱基正常配对，引起DNA构型发生多种多样的变化，如断裂、交联、改变遗传学性质等，从而引起突变[4]。选育出浸矿性能优良的微生物，以提高浸矿微生物的适应能力和浸矿能力，从而加快矿物浸出速率、浸出率，对提高我国矿产资源综合利用率，扩大资源利用范围，能有效缓解我国矿产资源短缺的局面。

2 方案论证

紫外线是一种最常用的、简便有效的物理诱变剂, 其作用波长主要集中在255 nm 附近, 这与一般细菌的DNA 吸收光谱相一致, 所以有较强的杀菌作用[5]。紫外线对细菌的有害作用是由于细胞中很多物质吸收紫外线。核酸、嘌呤、嘧啶对紫外线辐射吸收能力特别强。DNA 和RNA 的吸收峰260 nm、蛋白质的吸收峰在280 nm, 所以紫外线可引起诸如DNA 链的断裂、DNA 分子内和分子间的交联、核酸与蛋白质的交联、胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及胸腺嘧啶二聚体的形成等多种变化。其主要作用是胸腺嘧啶二聚体的形成。这种胸腺嘧啶二聚体的存在, 可以带来DNA 分子构型的扭曲, 从而影响它的正常复制、转录, 严重时可导致个体死亡, 在一般情况下则可能使DNA 的复制产生差错从而引起诱变效应[6]。当剂量选择和细菌样品处理适当时, 可能导致遗传基因发生变异, 从而创造新基因引起体内生化途径的改变, 产生新型菌株。

3 研究方法

3.1细菌的转代及驯化

3.1.1.细菌的富集

菌样取自实验室保存的2009年与2010年的两组细菌作为原始浸矿细菌，在9K培养基中进行培养，当观察到培养液由浅绿色变成黄褐色且有沉淀时，表示细菌生长状态已达到稳定期的峰值，此时选择颜色变成最快最深、Fe2+转化率最高的菌种进行接种培养。

在实验过程中，采用9K液体培养基作为基础培养基培养细菌，基础培养基的化学组成如下[7]：

(NH4)2SO4 3.0g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，蒸馏水1000mL，pH 2.0。

3.1.2.细菌的转代培养

将试样置于30℃、120r/min的摇床培养，培养时间以锥形瓶底出现较多的黄褐色沉淀为止，试验初期为了最大限度提高细菌活性培养一代的时间预计需一周左右，后期随着细菌活性的提高，可适当缩短培养时间，提高检测频率。本次实验拟按接种量10%连续培养转代，经过多次转代培养最终获得纯度较高的菌种。

3.1.3.摇瓶实验

实验的细菌转代操作步骤如下：

(1) 将100mL的基础培养基装入灭菌后的250mL锥形瓶内；

(2) 将三角锥瓶放入高压灭菌器消毒15~20min；

(3) 将定量菌液加入三角锥瓶内，用1：1硫酸将培养基的pH值调整为2.00左右；

(4) 加入定量的FeSO4.7H2O；

(5) 用棉纱封口置于30℃、120r/min的摇床摇床内浸矿。

实验过程中，定期监测溶液的pH值、Fe2+浓度，记录于表1。

表1转代过程中细菌的活性

3.1.4.浸矿驯化

本试验选取的矿粉来自羊拉铜矿，经破碎后用80目的筛子进行筛分，筛分后获得-0.2mm的矿粉，其物相和多元素分析结果见下表（引自《云南德钦盈科矿冶开发有限责任公司氧化铜矿综合回收试验报告》）：

表3羊拉铜矿物相及多元素分析表

根据细菌生长所需的能源来源方式，细菌驯化分为两种方案：从有能源物质环境逐渐过渡到无能源物质环境，即逐步过渡方案；直接在无能源物质环境中连续培养，即转代驯化方案。本次实验采用两种方案平行对比方式，即同时进行转代驯化和逐步过渡的方案，通过两种方案连续三代细菌培养，培育出耐受性最强的浸矿细菌。方案相关数据设置如表2：

表2细菌的驯化方案

具体步骤如下：

（1）将100mL的基础培养基装入灭菌后的250mL锥形瓶内；

（2）用1：1硫酸将培养基的pH值调整为2.00左右；

（3）加入经破碎机磨碎后的矿石粉10g；

（4）将锥形瓶放入摇床进行培养，转速设定为120rpm，温度设定为30℃。

细菌驯化过程中，液体培养基为100mL，矿浆浓度为10％，接种量为10％，观测每一代驯化所需时间，并每24小时取样监测溶液的pH值、电位、Fe2+浓度、Cu2+浓度，记录于表3。

表3 第一次测量的铜离子浓度

将菌样进行铜离子的耐受性培育后，所培育的菌种对羊拉铜矿的浸矿率分别为：过渡转代7.76%，直接转代3.82%。

再对两组菌样分别进行多次转代培养，液体培养基的配置均按照基础培养基100ml加10%的矿粉。在试验过程中通过培养基蓝色的深浅，初步判定对铜离子的浸出效率，分别选取转代训化和逐步过渡中颜色较深的菌样，将转代训化的菌样编号为Z-1、Z-2，逐步过渡的菌样编号为G-1、G-2，继续进行浸矿试验，并记录数据，如表4。

表4 第二次铜离子测量化验分析报告单

第二次检测时，直接转代的浸矿细菌对矿石的浸出作用已经明显增强，浸出率由3.82%提高到43.40%。而过度转代的浸矿效率开始变得相对较弱，仅由7.76%提高到40.95%。

表 5第三次铜离子测量化验分析报告单

第三次检测时细菌对铜矿石的浸出率基本保持在45%左右，可以进行下一步的诱变育种。由实验记录数据可知，通过直接转代的方法获得菌种浸矿效率相对较高，且浸矿率基本保持稳定，故选取编号为Z-1的菌种为原始菌种进行诱变实验。

3.2细菌的诱变

取15 W 紫外灯, 预热20min。在将已经驯化出的具有浸铜能力的菌株分别转代到三个锥形瓶中，每个锥形瓶配置为不含Fe2+的9K培养基，每瓶中放入10g 80目的铜矿粉，并注入10ml的菌液。对其进行编号为YB1m、YB2m、YB3m。置于距离灯管30cm处，分别照射1min，2min，3min。诱变试验应在避光环境下进行，以避免细菌的光修复[8]。将诱变后的细菌放入摇床中培养，最终提取菌液试样进行铜离子检测。诱变后的铜离子浸出量如表6：