HA在骨科方面的运用

透明质酸(hyaluronan/hyaluronica cid，HA)，也称为玻璃酸，是一种天然的高分子非硫酸化糖胺聚糖，由β-1，4-葡糖醛酸和β-1，3-N-乙酰-D-葡糖胺双糖重复单位组成，见图1。HA是人体组织中广泛存在的成分，在皮肤、软骨、椎间盘髓核、眼玻璃体和关节滑液中，均检测到高浓度的HA。HA所具有的独特的生物物理性质，如高黏度、高弹性和高负电荷，使得HA适用于多种治疗过程，特别是骨科疾病的治疗。现对近几年来HA应用于骨科的最新进展作一回顾。

1HA在骨关节炎(osteoarthritis，OA)治疗中的应用

OA是一种由于关节软骨退行性病变引起的中老年常见疾病，症状包括关节疼痛、功能障碍、关节畸形等。OA的关节宏观改变包括关节软骨的破坏、骨赘形成和骨-软骨接头的损伤。采用黏度补充疗法，即关节腔内注射HA能够提高关节滑液的黏弹性，部分恢复其性和减震性质，还能显著降低关节结构的恶化速度［1］。在OA的退化进程中，HA可通过抑制软骨基质蛋白聚糖聚集物的降解与增强蛋白聚糖及软骨细胞胞外基质的合成，发挥关节保护和抗炎效果［2-3］。HA能够降低炎症关节的伤害感知活性［4］，减轻关节疼痛［5］，并通过减少活性氧自由基、炎症介质和基质降解酶来保护软骨［2］。

关节腔内注射HA已广泛用于膝OA的治疗。凌沛学等［6］报道了国内近60家医疗单位对HA疗效的临床评价，肯定了HA在膝OA治疗中的有效性。临床多为每周给药1次，3～7周为1疗程。评价指标为严重度指数、关节疼痛、关节伸展度、晨僵、关节积液以及止痛药的摄入量等。患者注射2～3次后，症状获得明显改善。对关节疼痛的缓解最为明显和迅速，其次是关节活动度的改善。疗效与患者的严重度和病程具有相关性，对严重度较高的患者疗效较差。多数临床结果表明，HA具有较好的耐受性，未见明显的不良反应。少数资料报道的不良反应多局限于注射部位，如疼痛或肿胀，极个别的患者出现头痛和发烧等症状。不良反应常发生于注射后1～3d内，患者一般能够耐受，不需处理，2～3d内可自行消失［3］。

HA在髋、肩、踝和手OA中的应用也呈上升趋势。重度髋OA患者1周1次，连续3周接受HA治疗后，其疼痛和残疾评分显著降低，效果可维持至治疗后6个月［7］。HA在踝OA中的应用相对较少。Migliore等［8］对多种HA产品在踝OA中的应用进行了总结。临床试验结果显示，HA应用于踝OA的治疗是安全、有效的。肩、手部位的OA应用黏度补充疗法也能有效地缓解疼痛、改善关节功能［9-10］。

非交联HA在关节中消除较快，半衰期为20h左右［11］，因此临床使用1疗程需要持续3～5周，1周注射1次。交联HA关节腔注射剂在保留了HA良好的生物相容性的同时，延长了外源性HA在关节内的留滞时间，减少了1个疗程所需要的注射次数，为治疗OA的长效制剂［12］。已有多种交联HA产品用于OA治疗。对瑞典Q-Med生产的交联HA水凝胶Durolane的研究发现，大鼠膝关节单次关节内注射Duro-lane56d后仍具有镇痛作用［13］。Durolane在关节腔的半衰期可长达4周，单次注射即可达到HA注射液3～5次注射的疗效［14］。Krocker等［15］对50名OA患者单次注射Durolane，以视觉模拟法(VAS)和欧洲生活质量评分(EQ-5D)等指标对患病膝关节功能、疼痛度、生活质量几个方面进行评测。结果表明:注射2周后，关节功能及生活质量明显好转，在随后的22周内，所有受试者各项参数，包括生活质量、膝关节活动度、疼痛评分等明显改善。HylanG-F20是一种已在多个国家上市的交联HA产品。Chevalier等［16］报道一项安慰剂对照临床试验中，253例初期膝OA患者单次关节腔内注射HylanG-F206mL后，患者疼痛得到有效缓解，效果维持至给药后26周，且安全性与安慰剂相近。多项临床研究结果表明，HylanG-F20对疼痛的缓解作用与皮质激素类相近，虽起效较慢但作用时间大大延长，且其不良反应发生率显著低于皮质激素类。长期服用非甾体抗炎药(NSAID)的膝和髋OA患者经HylanG-F20治疗后，NSAID的服用量大幅降低［17］。

但目前各种评价关节内注射HA(包括交联HA)治疗OA的有效性的临床研究结果仍存在着矛盾性［18-20］。这种差异可能与研究方案的设计、临床终点的设置、评价方法、意向-治疗分析的缺失、患者人群和所使用的药物有关。需采用患者数量更多、随访时间更长的随机对照试验来进一步客观、全面地评价黏度补充疗法对OA的作用，确定最能够从该疗法中获益的患者人群［21］。

2HA在软骨和骨组织工程中的应用

2.1在软骨组织工程中的应用组织工程是一种治疗关节软骨损伤的新兴技术，该项技术在软骨组织的修复中已取得了良好的早期结果。种植特定细胞源和生物活性分子的支架是该技术的关键［22］。HA作为一种生物材料，具有生物相容性、无毒性、非免疫原性和非致炎性，这些性质使其适合用作软骨组织工程的细胞载体［23-24］。天然HA水溶性极强，且缺乏支架所必需的力学性能，现有的研究多采用HA(及其衍生物)与其他材料制备复合组织工程支架。近年来，以HA为基础的软骨组织工程支架的研究取得了长足进展。

目前软骨组织工程支架的种子细胞多采用软骨细胞。软骨细胞在单层培养系统中容易失去其表型特征，而在三维构造中会维持其原始特征［25］。将HA加入接种了关节软骨细胞的胶原支架中，能够改善三维环境，改善软骨细胞的生长、功能和基质的沉积［26］。将人关节软骨细胞在HA的苄基衍生物HYAFF-11上培养3周，与培养在塑料上的软骨细胞相比，Ⅱ型胶原、转录因子Sox9和聚蛋白多糖显著增多，Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶(MMP)的表达下降［27］。来源于牛［28］、兔［29］、大鼠［30］和猪［31］软骨的软骨细胞包封在以HA为基础制备的支架后，发生软骨细胞再分化，蛋白聚糖合成增强，Ⅱ型胶原和软骨寡聚基质蛋白的表达提高。以上研究表明了HA在促进软骨基质合成、维持软骨细胞表型方面的有效性。

水凝胶能够更好地模拟细胞外基质的水合环境，因而成为软骨组织工程支架的一种重要形式，近年来发展的基于HA的支架大多采用这种形式。Pereira等［32］开发了一种新型可注射角叉菜胶/纤维蛋白/HA复合水凝胶。体外细胞培养研究显示，种植的人关节软骨细胞能够增殖并形成软骨特定细胞外基质。将种植了人软骨细胞的可注射水凝胶填充于实验形成的牛软骨块缺损，形成器官复合体。裸鼠皮下植入该器官复合体6周后，观察到牛关节软骨的再生。Tan等［33］通过琥珀酰-壳聚糖和醛化HA的原位交联获得了一种注射型复合水凝胶。包封于其中的牛软骨细胞24h后仍保持高活力和正常形态。Jin等［34］模拟软骨细胞胞外基质中蛋白聚糖的结构，合成了一种酪胺偶合葡聚糖-HA多糖杂化物，经酶催化交联后形成一种仿生水凝胶。研究显示，这种仿生水凝胶具有良好的生物相容性，并可为软骨细胞的增殖、分化及基质沉积提供支持性的微环境，适合用作注射型软骨组织工程支架。总之，以上研究显示基于HA的支架适合用作软骨再生中软骨细胞的传递工具。

骨髓多能间充质干细胞(bone marrow multipotentme senchymalstem cell，BMMSC)是软骨组织工程的另一种常用的种子细胞。与软骨细胞相比，MSC体外易扩增，并且不会丢失分化能力。近年来，已采用多种生物材料来构建三维支架，形成适宜的微环境，控制干细胞的行为和分化，促进和诱导软骨组织形成。这其中包括相当数量的以HA及其衍生物为基础的支架。MSC的增生和分化中表达HA受体CD44［35］，以HA为基础的支架可能通过与CD44的相互作用影响干细胞的分化。Chung等［36］采用甲基丙烯酸酯化HA水凝胶对MSC在HA微环境中的软骨形成情况进行了研究，并与相对惰性的聚乙二醇水凝胶进行了对比。结果显示，HA水凝胶中Ⅱ型胶原的表达为聚乙二醇水凝胶中的43倍，提示HA对MSC的软骨定向分化有显著促进作用。

Pasquinelli等［37］检查了HA苄基衍生物(HYAFF-11)对种植的大鼠MSC的活力及增生的影响，实验中未进行化学诱导。种植24h后，约96%的细胞黏附于HYAFF-11表面，覆盖了整个支架表面的约12%。其后，细胞对支架的黏附稳步提高，21d后覆盖了支架表面的约40%。培养3d后即观察到MSC迁移至支架内部，7d后MSC即均匀地分布于支架内。培养21d后，发现细胞外周出现少量胶原纤维和粒丝状蛋白聚糖及丝状基质结构。种植于HYAFF-11的MSC的高活力、高黏附率及两者之间的良性相互作用说明该支架具有应用于软骨修复的潜能。一种将HA的生物学特征和丝素蛋白的优良机械性质相结合的HA-丝素蛋白复合支架与简单的丝素蛋白支架相比，能够使得BMMSC进行更有效的分化和组织形成［38］。将BMMSC种植于HA/明胶复合支架，然后植入家兔模型的内侧半月板缺损，12周后经检查发现BMMSC发生软骨分化，且植入的支架与宿主组织相结合［39］。

2.2在骨组织工程中的应用

近年来的研究表明，以HA为基础的支架(多采用水凝胶形式)适合用作种子细胞和诱导骨形成的活性分子的载体，应用于骨组织工程。Kim等［40］制备了一系列以HA丙烯酸酯为基础的水凝胶。将以硫代聚乙二醇为交联剂制备的水凝胶与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)-2和MSC共同孵育，得到复合支架。该支架植入颅骨损伤部位后，能够促进骨钙素表达和成熟骨及血管的形成，提示这种水凝胶适合用作组织工程中的细胞和生长因子的载体。又将HA丙烯酸酯与对MMP敏感的肽(GCRDGPQGI-WGQDRCG)相连接，制得对MMP敏感的水凝胶。这种水凝胶与BMP-2形成的复合支架能够促进颅盖骨缺损的重建和再生［41］。Antunes等［42］在聚乳酸三维多孔支架表面覆盖戊二醛交联的HA来增加支架表面的粗糙程度，交联HA的引入未增加支架的细胞毒性，两者形成的复合支架更有利于骨组织工程应用。Chen等［43］对一种热可逆性可注射聚合物水凝胶(HA-CPN)在骨组织工程中的应用进行了研究。这种水凝胶是通过将HA和末端为羧基的聚异丙基丙烯酰胺接枝于壳聚糖骨架获得。将犬MSC种植于该凝胶，形成细胞-支架复合物(MSC/HA-CPN)。体外对MSC/HA-CPN进行7d的成骨诱导，其碱性磷酸酶活性和钙含量明显提高，提示该支架适用于骨形成和骨组织再生，是一种理想的三维细胞载体。

3以HA为基础的凝胶用在BMP的载体中的应用

BMP具有诱导成骨的作用，可以用来促进骨折愈合、修复骨缺损等，其中以重组人BMP-2在骨科应用最为广泛。BMP植入体内后，很快被扩散稀释或酶解吸收，难以在新骨形成的全过程中充分发挥其诱导成骨作用，因此需要有合适的载体，在成骨过程中发挥支架作用的同时使BMP得到缓慢释放［44］。研究表明，以HA为基础的凝胶适合用作BMP-2的载体，实现BMP-2的控制释放，在体内获得持续的诱导骨形成作用。

Bergman等［45］采用双筒注射器将HA醛衍生物及聚乙烯醇酰肼衍生物与BMP-2的混合液注射入大鼠股四头肌，通过原位交联形成水凝胶。4周后观察到凝胶植入部位有异位骨形成，其体积与植入的凝胶体积相当，骨矿物质密度接近于股骨。研究结果表明，这种可注射水凝胶可采取最小侵袭性方法，作为运送BMP-2的无细胞支架，应用于骨组织形成。Martínez-Sanz等［46］制备了HA的醛衍生物和酰肼衍生物，交联后获得无细胞毒性的凝胶。体外试验显示，这种水凝胶能实现活性BMP-2的控制释放。将携带BMP-2的水凝胶注射入大鼠颅盖，8周后观察到骨组织形成。组织学检查显示，新形成的骨高表达骨钙素和骨桥蛋白，提示该凝胶可作为BMP-2的载体，促进骨量扩增。

4HA在制备骨组织替代物中的应用

由于机械强度较弱，HA单一成分不适合作为骨组织的替代物，往往需要与其他成分混合制备骨替代物。Pek等［47］采用纳米晶体羟基磷灰石和交联的HA-酪胺轭合物制备了一种骨水泥，与传统骨水泥相比具有极低的热释放量，能够避免对周围组织的损伤，并成功修复了小鼠小型骨及关节缺损。

5HA在椎间盘再生(intervertebral disc，IVD)中的应用

潜能IVD是一种无血管、无神经结构，由外部纤维环、内部胶状髓核和邻近的软骨终板构成。与软骨组织类似，IVD损伤的自愈能力较弱。IVD的退行性改变能够进一步影响其他脊柱结构，并最终导致大范围的结构异常和正常运动节段功能的损失［48］。

近年来组织工程技术在IVD受损组织再生中的应用得到迅速发展，HA是构建组织工程支架的常用天然生物材料之一。Halloran等［49］制备了非交联和酶交联胶原-HA复合支架。将牛髓核细胞种植于支架中，并培养7d，观察到交联复合支架未对细胞活力和增生产生任何负面影响。与非交联支架相比，种植于交联支架中的细胞其蛋白聚糖合成率较高，硫酸化糖胺聚糖的流失较少。Nesti等［50］将人BMMSC种植于包封HA水凝胶的生物可降解纳米纤维复合支架中。这种复合支架的外层为聚乳酸纳米纤维，内层注入HA水凝胶以提供支撑结构，并提高复合支架在细胞增生、分化中的生物相容性。体外培养28d，加入转化生长因子β诱导软骨形成。在体外培养中，种植细胞逐渐发育为软骨细胞表型，这些细胞保持了天然IVD的微结构。形成的软骨样HA纳米纤维支架复合体的结构与天然的IVD相似，都具有外部纤维环样结构和内部髓核样结构。总之，这种MSC/HA的IVD复合体具有应用于退化IVD的组织工程修复的潜能。Revell等［51］检查了2种HA衍生的生物可降解聚合物，HYAFF-120和HYADD-3在猪髓核切除术模型中对受损IVD的修复作用。研究中将自体BMMSC种植于HA凝胶中，然后注入切除髓核后的IVD中。与仅实施髓核切除术的对照组相比，种植或不种植MSC的植入HA凝胶都维持了髓核的正常两面凸起结构，6周后都含有形成基质的活软骨细胞。Cal-deron等［52］研制了一种交联Ⅱ型胶原-HA复合水凝胶，作为MSC的载体，应用于髓核的再生。这种水凝胶具有良好的稳定性和机械强度，种植的MSC细胞活力高，生长情况良好，并分化为软骨细胞。近年来的研究成果表明，HA可构建工程化IVD，用于IVD的修复和再生。

6HA寡糖对骨肉瘤的抑制作用

骨肉瘤是一种较常见的恶性骨肿瘤，易发于青少年，死亡率高。Hosono等［53］研究发现，外源性HA寡糖对LM-8和MG-63骨肉瘤细胞有显著的抑制作用。细胞活力分析和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP原位切口末端标记的分析结果分别表明，HA八糖可以显著抑制肿瘤细胞活力，并可诱导其凋亡。八糖还可以削弱细胞基质的功能，并显著降低内源性HA的存留量。另外，八糖能够抑制肿瘤细胞的迁移和入侵。肺是骨肉瘤转移的主要靶器官，应用化疗前，80%～90%的患者死于肺转移［54］。在体肿瘤内注射HA八糖可降低内源性HA在肿瘤部位的聚集，从而显著抑制了肺癌远端转移灶的形成。Nishida等［55］在2010年第8届Hyaluronan国际大会上再次公开了以上研究结果。以上研究表明，HA寡糖具有开发为抗恶性骨肿瘤药物的潜能。

7总结

综上所述，HA及其衍生物在骨关节炎的治疗、软骨和骨组织工程、IVD的再生和骨肉瘤的治疗中有很大的应用潜力。HA及交联HA在骨关节炎治疗中的应用已趋于成熟，已有多种产品上市，但临床试验结果的矛盾性仍要求对其疗效进行全面、深入地评价。组织工程是近年来修复骨及软骨损伤的新兴技术，以HA为基础的支架在软骨和骨及椎间盘再生等组织工程中显示出诱人的应用前景，但尚需进行大量的体外和体内研究，确定HA(或其衍生物)与其他生物材料、细胞、生长因子的最佳组合。HA寡糖对骨肉瘤显示出一定的抑制作用，有可能发展成为治疗恶性肿瘤的新型药物。