蝮蛇蛇毒中小分子肽抑制血小板聚集作用的研究

【摘要】:目的:研究华南地区蝮蛇粗毒中分离得到的蛇毒多肽AHP-4的抑制血小板聚集作用。方法:分别用二磷酸腺苷、胶原和花生四烯酸诱导兔血小板聚集,观察不同剂量的AHP-4对血小板聚集的抑制率,并计算IC50。结果:AHP-4在体外可剂量依赖性地抑制由二磷酸腺苷、胶原和花生四烯酸诱导的兔血小板聚集,其IC50分别为25.4nM、256.6nM、11.2nM。结论:从AHP-4对这三种诱导剂诱导的体外兔血小板聚集的作用来看,其作用机制可能如下:阻断二磷酸腺苷与二磷酸腺苷受体的结合;抑制花生四烯酸的代谢产物的生成;抑制血小板膜上磷脂酶的激活。

【关键词】:蝮蛇蛇毒;血小板聚集;二磷酸腺苷;胶原;花生四烯酸

【中图分类号】R222.16【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-013-2

血小板聚集在血栓形成的过程中起着关键作用,因此,抗血小板聚集药物成为治疗血栓疾病药物的重要组成部分。目前,已从蛇毒中分离纯化得到了多种具有抑制血小板聚集作用的蛋白组分,但至今未有蛇毒蛋白组分作为药物进入临床。本研究以华南地区蝮蛇粗毒分离得到的分子量为7554Da的AHP-4蛇毒多肽为样品[1],对其抗血小板聚集的活性进行评价,并对其机制进行了初步探讨。

1实验材料和仪器

本实验室分离纯化的蛇毒多肽AHP-4[1][2],二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP,美国sigma公司),胶原(collagen,COL,自制),花生四烯酸(arachidonic acid,AA,美国sigma公司),枸橼酸钠(光华试剂厂),0.9%生理盐水(昆明市宇斯药业有限责任公司),新西兰家兔不限,体重(2.52±0.42kg)(南方医科大学南方医院实验动物中心提供),离心机LXJ-Ⅱ(上海医用分析仪器厂),玻璃微量进样器0-50μl(上海医用激光仪器厂),硅化加盖试管10ml(五洲医用塑料厂),比浊管(北京普利生公司),小磁棒(北京普利生公司),LBY-NJ血液凝聚仪(北京普利生公司)。

2方法

2.1胶原的制备[3]取剃毛后的一块大鼠皮肤,剪碎,按湿重每0.1g加入1ml生理盐水,磨成匀浆,以3000转/min离心10分钟,吸取上清液,放置冰箱4℃备用。

2.2血小板诱导剂的浓度ADP诱导血小板聚集的终浓度为17.65μM,胶原血小板聚集的终浓度是4.8μg/ml,AA诱导血小板聚集的终浓度是14.70μM。

2.3AHP-4的实验浓度AHP-4的浓度分别配制成8nM、16nM、32nM、64nM、138nM,276nM和552nM备用,根据预实验的结果,不同诱导剂诱导血小板聚集的实验,需选择AHP-4的不同浓度进行实验。AA和ADP作为诱导剂诱导血小板聚集时,AHP-4选用的浓度是8nM、16nM、32nM、64nM、138nM;在COL诱导血小板聚集实验,AHP-4选用的浓度是32nM、64nM、138nM,276nM和552nM。

2.4血小板实验新西兰家兔耳中动脉穿刺取血9ml,与3.8%枸橼酸钠混合(9:1,V/V),室温下800r/min离心10min,取上层血浆,即为富血小板血浆(platelet2rich plasma,PRP),下层红细胞3000r/min离心10min,上清液为贫血小板血浆(platelet poor plasma,PPP)。血小板聚集实验在LBY-NJ的血小板聚集仪上进行。以PPP调PRP使透光度在30左右(血小板数在2×109/ml)。分别取200μl调过的PRP与40μl不同浓度的样品或生理盐水于比浊管中37℃下孵育至少5min,在电磁搅拌下分别加入致聚剂ADP10μl(终浓度300μmol/L),胶原10μl(终浓度4.8μg/ml),花生四稀酸(终浓度14.70μmol/L)诱导血小板聚集,观察样品对血小板聚集的影响,比较空白PRP与样品PRP在3min内最大聚集程度,计算聚集百分率和样品抑制聚集百分率。

2.5数据处理

血小板聚集抑制率=[(对照聚集%-药物聚集%)/对照聚集%]×100%。用Origin6.0统计软件作出剂量依赖曲线。50%聚集抑制剂量(50percent inhibitory on centration,IC50)用直线回归方程求出。

3结果

3.1AHP-4对ADP诱导的血小板聚集的活性作用,IC50是25.4nM。

图1 剂量依赖方式一致ADP诱导的兔血小板聚集

Fig1 Inhibition of platelet aggregation induced by ADP in dose-dependent manner

3.2AHP-4对胶原诱导的血小板聚集的活性作用,IC50是256.6nM。

图2 剂量依赖方式一致COL诱导的兔血小板聚集

Fig2 Inhibition of platelet aggregation induced by COL in dose-dependent manner

3.3AHP-4对AA诱导的血小板聚集的活性作用,IC50是11.2nM。

图3 剂量依赖方式一致AA诱导的兔血小板聚集

Fig3 Inhibition of platelet aggregation induced by AA in dose-dependent manner

4讨论

本文首次对从中国大陆华南地区的蝮蛇蛇毒中分离出一种新的蛇毒多肽AHP-4的抑制血小板聚集的作用进行了研究,并对其作用机制进行了初步探讨。本研究以ADP、AA和COL作为血小板聚集的诱导剂,研究了AHP-4的抗血小板作用。从血小板的抑制率来看,无论是哪种诱导剂,AHP-4对血小板聚集的抑制作用呈剂量依赖关系,亦即AHP-4浓度越高,对血小板聚集的抑制作用就越强。上述结果表明AHP-4在体外可剂量依赖性地抑制由AA、ADP、胶原诱导的兔血小板聚集,其IC50分别为11.2nM、25.4nM、256.6nM,其效应的强度是AA>ADP>COL。说明AHP-4对不同诱导剂诱导的血小板聚集作用有一定差异。

上述三种诱导剂诱导血小板聚集的机理及方式有所区别,ADP与血小板膜上的ADP受体结合,引起血小板的变形、聚集,最后促进TXA2的形成;AA在环氧合酶的作用下,生成不稳定的环内过氧化物,通过血小板中的TXB2的合成酶催化变成TXA2;胶原的作用机制则是通过激活血小板膜上的磷脂酶,分解磷脂酶后释放出AA。

因此,从AHP-4对这三种诱导剂诱导的体外兔血小板聚集的作用来看,其作用机制可能如下:阻断ADP与ADP受体的结合;抑制花生四烯酸的代谢产物的生成;抑制血小板膜上磷脂酶的激活。

参考文献

[1] 吴少瑜,王广发,吕琳等.一种新的蝮蛇蛇毒蛋白组分的分离纯化及其对肿瘤细胞的作用[J].中药材,2009,32(12):1878-1880.

[2] 马安德,吴少瑜,张嘉杰等.一种新的蝮蛇蛇毒磷脂酶A2同源物的分离纯化及其氨基酸序列分析[J].中药材,2006,29(2):132-134.

[3] 徐理纳.血小板聚集性测定方法药理学实验方法(第三版)[M].北京:人民卫生出版社,1998.9.