温州地区丙型肝炎病毒感染者基因型分布特征及其临床意义分析

[摘要] 目的 探讨温州地区丙型肝炎病毒感染者基因型分布特征及其临床意义。 方法 收集2010年1月～2012年12月温州市中心血站自愿献血者244例，其中，HCV感染经ELISA方法证实为HCV抗体阳性者122例，健康者122例，收集同期来温州地区某医院门诊肝病患者122例，所有对象均静脉采血，HCV RNA提取，AMV反转录，并采用巢式PCR扩增对研究对象进行HCV-RNA的检测及基因分型。 结果 门诊肝病患者1 b总阳性率为100.0%，HCV抗体阳性者1 b总阳性率为95.9%，健康者1 b总阳性率为0.0%，三者比较，差异有统计学意义（χ2=10.28，P < 0.05）。122例肝病患者中1 b型所占比例最高，且在重度病变及肝硬化患者中占比最高（P < 0.05），不同肝病程度间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 温州地区HCV的基因型以1 b型占优势，由1 b型感染所致疾病的病情较为严重。

[关键词] 丙型肝炎病毒；基因型分布；1 b基因；温州

[中图分类号] R512.63 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）01（c）-0058-03

Distribution characteristics and its clinical significance of hepatitis C virus infection genotype in Wenzhou City

LIN Rong WANG Bin LIU Yanfei

Center Blood Station in Wenzhou City， Zhejiang Province， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To study the distribution characteristics and its clinical significance of hepatitis C virus （HCV） infection genotype in Wenzhou City. Methods 244 cases of voluntary blood donors in Center Blood Stations in Wenzhou City from January 2010 to December 2012 were selected， in which there were 122 cases of HCV infection confirmed by ELISA， and 122 cases of health body， at the same time 122 cases of hepatopath in Outpatient Clinic of a hospital in Wenzhou City were collected. All objects were all given venous blood sampling， HCV RNA was extracted， AMV was reversed， the nested PCR amplification was used for HCV-RNA and genotyping detection. Results Among all cases of the object of study， 1 b total positive rate in hepatopath was 100.0%， and was 95.9% in voluntary blood donors with HCV antibody positive， and was 0.0% in health voluntary blood donors， the comparison had significant difference （χ2=10.28，P < 0.05）. The proportion of type 1 b among 122 hepatopath was the highest， which was the highest in severe and cirrhosis of the liver （P < 0.05）， the comparison between different degrees was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion 1 b type of HCV genotypes in Wenzhou City is high， the disease is more serious caused by 1 b infection.

[Key words] Hepatitis C virus （HCV）； Genotype distribution； 1 b gene； Wenzhou City

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是黄病毒科肝炎病毒，为RNA正链病毒[1]。鉴于HCV基因组的变异性较大，故HCV存在不同的基因型。目前，根据Simmonds分型系统共有6个基因型，68个亚型。我国主要以1a、1b、2a、2b、3a基因型为主，且均有相关报道文献[2]。我国HCV感染率较高，平均为3.2%，该类感染可导致慢性肝炎、肝硬化、肝癌等病症，其临床症状的轻重程度与感染基因型相关，一般1b型较非1b型肝功能损害病情严重，易恶化[3-5]。因此，对HCV感染区分基因分型对于丙型肝炎的个体化治疗作用明显。本研究采用PCR技术对温州地区HCV感染者进行基因型研究，了解本地区患者主要基因型，以探讨HCV基因型的分布特征，并分析基因型与病情的关系，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年1月～2012年12月温州市中心血站（以下简称“我站”）自愿献血者244例，经ELISA方法证实HCV抗体阳性者122例，年龄23～56岁，其中男68例，女54例；健康者122例，年龄20～58岁，其中男70例，女52例。收集同期温州某医院门诊患者122例，其中，输血后丙肝14例，男4例，女10例，年龄15～64岁；散发性丙肝25例，男15例，女10例，年龄17～60岁；肝硬化40例，男27例，女13例，年龄11～69岁；原发性肝癌43例，男21倒，女22例，年龄23～68岁。采集静脉血，全部血清标本均来自我站检验科及医院门诊患者。所有患者诊断均符合2000年9月西安第10次全国传染病与寄生虫病和肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的标准：血清抗-HCV阳性、HCV RNA>80 copies/mL，伴或不伴肝功能异常，均伴有不同程度的肝硬化。两组研究对象年龄、性别比例等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。且研究对象均知情同意，已经我站业务科通过。

1.2 试剂

全血RNA提取试剂盒（北京艾比根生物技术有限公司）；HCV抗体诊断试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）；Taq酶、引物、RNA酶抑制剂（上海玉博生物科技有限公司）；M-MuLV逆转录酶（Simga公司）。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物设计 自Genebank中查找HCV 1a、1b、2b、3a型全序列，查找各型5′ UTR区共同序列，并以此自行设计引物。外引物：S1（nt34～54）：5′-ATCACTCCCCTGTGAGGAAC-3′；S2（nt279～299）：5′-CCCTATCAGGCAGTACCACA-3′；内引物：S3（nt39～59）：5′-TCCCCTGTGAGGAACTACTG-3′；S4（nt274～294）：5′-TCAGGCAGTACCACAAGGCC-3′。

1.3.2 HCV RNA提取及AMV反转录 所收集的血清，12 000 r/min离心10 min，取上清，-70℃冰箱保存备用。利用Trizol法提取备用血清中的病毒RNA，具体操作方法为：于30 μL血清中加入Trizol溶液、氯仿及异丙醇，预冷振荡并洗涤，所得RNA于-70℃超低温冰箱中保存备用。另外在EP管中依次加入模板RNA、oligo（dT）16、dNTPmixture、RNase Inhibitor、AMV及DEPC水，混匀均匀，42℃保温1 h，95℃保温5 min后冰上冷却后，行反转录。

1.3.3 巢式PCR扩增和酶切反应 于EP管中分别加入cDNA模板，Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer，上游引物（25 mmol/L）、下游引物1μL，dNTP，灭菌去离子水，行扩增，并于95℃预变性4 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，70℃延伸30 s，70℃延伸5 min，进行35个循环后得到第1轮扩增产物。以其为模板，等同条件下行第2轮扩增。取第2轮PCR产物，分别加入19.5 μL Hae Ⅲ和Bsh 1236Ⅰ及buffer溶液，37℃水浴2 h，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

1.4 统计学方法

所有数据采用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-巢式PCR检测HCV-RNA结果

1b阳性（144 bp）、2a阴性表达；1b阴性、2a阳性（174 bp）表达；1b阳性（144 bp）、2a阳性（174 bp）表达，见图1。

从左至右分别为1b阳性（144 bp）、2a阴性，1b阴性、2a阳性（174 bp），Marker（从上至下分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500 bp），1b阳性（144bp）、2a阳性（174bp）

图1 温州地区HCV分型凝胶电泳图

2.2 HCV-RNA基因分型结果

结果显示，所有研究对象中，门诊肝病患者1b总阳性率为100.0%，HCV抗体阳性者1b总阳性率为95.9%，健康者1b总阳性率为0.0%，三者比较，差异有统计学意义（χ2=10.28，P < 0.05），提示该地区1b基因型所占比例较大。见表1。

2.3 基因型与患者病情的关系

以门诊患者不同病变程度占比进行统计，结果显示，122例患者中1b型所占比例最高，且主要分布在重度病变及肝硬化患者中（P < 0.05），不同程度间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。提示1b型感染所致疾病病情较为严重。见表2。

表2 基因型与患者病情的关系

3 讨论

HCV基因组变异明显，分型较多，平均每个位点的核苷酸变异频率每年可达0.001[6-7]。HCV不同基因型可影响患者的病情及其进展。本研究利用较为保守的5′ UTR区进行RFLP法分型，对1a～6a不同基因型的cDNA扩增效果较为明显。不同地区的HCV基因分布不同，欧美国家主要为1a型，亚洲国家主要为1b型[8]。文献显示，1b基因型对疾病的影响较为严重，可导致肝坏死及纤维化，且该类病毒的复制能力较强，危险系数较大[9]。

HCV基因型分布存在地区差异。研究报道我国南方沿海城市1b型占90%以上，北方城市2a型占62%左右[10-11]。HCV包括多种基因型，将Okamoto和Simmonds提出的两种分类方法结合起来可以把HCV基因型分为Ⅰ/1a、Ⅱ/1b、Ⅲ/2a、Ⅳ/2b、Ⅴ/3a、4a、4b、4c、4d、5a 和Ⅵ/6a，其中Ⅱ/1b和Ⅲ/2a是我国主要流行的基因型。人感染HCV后机体不产生保护性抗体，另外针对HCV感染也缺少有效的治疗药物。虽然干扰素是目前公认的抗HCV的有效药物，但是，国内外的研究资料表明，HCV基因型对干扰素有明显影响[7-8]。因此，在干扰素治疗前，提前测定患者所感染HCV的基因型对于治疗非常重要。另外，人感染HCV以后，肝脏疾病的严重程度也各异，这与所感染的HCV基因型也有关，所以研究HCV不同血清型在人群中分布情况可以为HCV的诊断和治疗等方面提供重要的科学依据。我国其他地区虽然进行了HCV基因型分布的探讨，但是在温州地区还未开展。关于浙江温州地区HCV不同基因型分布情况相关的研究不多。本研究结果显示，所有研究对象中，门诊肝病患者1b型总阳性率为100.0%，HCV抗体阳性者1b型总阳性率为95.9%，健康者1b型总阳性率为0.0%，三者比较，差异显著（P < 0.05），提示该地区1b型所占比例较大。122例肝病患者中1b型所占比例最高，且主要分布在重度病变及肝硬化患者中（P < 0.05），不同程度间比较差异有统计学意义（P < 0.05）。提示，1b型有较高的复制能力和血清反应性，较强的肝细胞损害作用及较低的IFN治疗反应性等，由其感染所致疾病病情较为严重，HCV基因型与特定的组织病理学程度、肝脏炎症程度相关。

综上所述，本研究在一定程度上反映了温州地区HCV基因型分布情况，对当地丙型肝炎患者的治疗和预后判断有一定的指导意义。但由于本研究对象例数不多，还不能完全反映温州地区HCV不同基因型具体分布情况，且研究对象以慢性肝病为主，缺乏无症状患者，有必要扩大样本量，选择人群资料进一步研究。

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（收稿日期：2013-10-25 本文编辑：程 铭）