人用H5N1禽流感疫苗免疫动物效果观察

作者：朱智勇，丁晓航，朱函坪，李岩金，陈学奎，沈吉友，张涛，何培江，姚苹苹，徐芳，翁景清，龚华岳，郭志军，苏波，孙淑滨，梁伟峰 【关键词】 禽流感疫苗；免疫动物;中和抗体；效力试验

摘要： 目的 将用禽流感毒种R1203株按3种生产工艺生产的疫苗进行动物接种,观察疫苗的免疫效果。方法 用不同剂量的3种工艺生产的禽流感疫苗，分别免疫大鼠和家兔，肌肉接种2针（隔14d），首针后14和28d静脉采血，测定接种1针和2针后，动物血清中血凝抑制抗体和中和抗体的产生情况。结果 大鼠的抗体反应较家兔敏感；大鼠和家兔在疫苗接种1针后14d,都能产生血抑抗体,滴度可达1∶40,但中和抗体滴度都很低,几乎测不到；接种2针后,血抑抗体或中和抗体反应都显著高于第1针；裂解-2苗接种大鼠和家兔后的抗体反应普遍高于另2种疫苗,且家兔量-效反应明显。结论 裂解-2疫苗优于其他2种；中和抗体能正确反应疫苗的质量；H5N1禽流感疫苗的效力试验可用于免疫家兔测定中和抗体和临床前研究的动物试验，用15μg血凝素(HA)接种家兔2针，血清中和抗体滴度达1:40或以上。

关键词： 禽流感疫苗；免疫动物;中和抗体；效力试验

Observation on effect of avian influenza (H5N1) vaccine with immunization animals

Abstract： Objective The vaccines produced according to the three techniques with the virus seeds R1203 of H5N1 avian influenza were used to immunize animals and to observe the effect.Methods Rats and rabbits were immunized with the different dose of the three vaccines of avian influenza (H5N1) by an intramuscular injection twice (interval 14 days). Blood was collected intravenously in the day of 14 and 28. The hemagglutination inhibition antibody and neutralization antibody occurred in the serum of the animals after the first and second inoculation.Results The antibody reaction in the rats was more sensitive than the rabbits. The rats and rabbits both could produce hemagglutination inhibition antibody in 14th day with the titer of the antibody reaching at 1:40 while the titer of the neutralization antibody was very low and hardly detected. The second inoculation were significantly higher than the first inoculation. The antibody reaction after inoculation of the split2 vaccine in the rats and rabbits were significantly stronger than that inoculated with another two vaccines. The quantumeffect reaction was distinct in the rabbits. Conclusion The production technique of split2 vaccine was better than the other two. The neutralization antibody can accurately reflect the quality of vaccines. The efficiency test should be added in vaccines research and production with the method of immune rabbits. It is suggested to immunize rabbits twice with 12μg HA with the titer of the seraneutralization antibody reaching at 1:40 or over in animal test before clinical trial.

Key words： avian influenza vaccine;immune animal;neutralization antibody;efficiency test

前期禽流感疫苗毒种的检定及毒种库的建立研究结果表明，引进的2株H5N1禽流感毒种R1194和R1203均可用于疫苗的生产。最初用R1194株，按2005年《中国药典》三部制造流感全病毒疫苗的规程〔1〕，生产一批全病毒疫苗，进行接种动物的预备试验取得一定效果。2005年底，国内外禽流感疫苗研究有了新的进展，特别是在疫苗中加入佐剂，使有效接种剂量不断降低。又根据禽流感疫苗生产的工艺设计及检定研究结果，设计3种生产疫苗的纯化工艺，用R1194株或R1203株都能生产出高质量的疫苗，但R1203株生产疫苗的产量较R1194株高，因此，在正式试验时我们确定用R1203毒种生产的3种疫苗，进行动物接种，观察它们的免疫效果。结果报告如下。

1 材料与方法

11 毒种 H5N1禽流感毒种R1194(英国国家生物制品检定所)和R1203株(美国疾病控制中心)。

12 疫苗 (1)用R1194毒株，按《中国药典》三部2005版流感全病毒灭活疫苗的方法制备(批号20051201)〔1〕。(2)用R1203毒种，按本研究第2部份制订的生产工艺生产的3种疫苗：全病毒疫苗（批号20060301），裂解-1疫苗（批号20060401-1），裂解-2疫苗（批号20060401-2）。

13 动物 大鼠：SD种群，45～50g。家兔：新西兰种群，20～25kg。小鼠：昆明种群，18～20g(浙江省动物中心)。鸡:三黄鸡，15～20kg(浙江慈溪养鸡场)。

14 佐剂 氢氧化铝(浙江天元生物药业公司)。

15 动物免疫预备试验 用不同剂量的血凝素(HA)，采用大剂量的试验方案：(1)疫苗：R1194株制备的全病毒疫苗。(2)动物：家兔，小鼠，鸡。(3)佐剂：氢氧化铝，有或无。(4)剂量：30, 60, 90μg/只，0，14d 2针。(5)接种途径：肌肉，皮下。

16 动物免疫正式试验 (1)毒种：R1203；(2)疫苗：全病毒疫苗、裂解-1疫苗、裂解-2疫苗3种；(3)动物：大鼠(每组10只)，家兔(每组4～5只)；(4)佐剂：氢氧化铝；(5)接种途径：肌肉；(6)剂量(HA)：075, 15, 30, 60, 120μg/只,0，14d 2针；后又在家兔组中,用裂解-2疫苗,增加30和45μg 2组；(7)血抑试验用的血凝素为R1194株，中和试验用的攻击毒株为R1194株。首针和加强接种前当天及加强接种后14d，各静脉采血1次，共3次，分离血清，-30℃以下冻存。

17 血抑抗体检测 按常规法，抗原为R1194或R1203 的血凝素。

18 中和抗体检测 在蛋胚中测定，固定病毒，稀释血清，等量混合，37℃中和90min，每只鸡蛋接种鸡胚感染剂量100(EID50)。

2 结果

21 动物免疫预备试验 (1)敏感性为家兔>小鼠>鸡。(2)佐剂苗的免疫效应优于无佐剂苗。(3)剂量之间(30,60,90μg HA) 测得的中和抗体或血抑抗体量-效反应不明显。(4)肌肉接种的免疫效应优于皮下接种。(5)血抑抗体或中和抗体,2针高于1针。

图1 大鼠和家兔不同剂量接种1针和2针后血抑抗体滴度（略）

图2 大鼠和家兔不同剂量接种2针后中和抗体滴度（略）

22 动物免疫正式试验(图1，2) 根据对免疫动物血清抗体的检测结果：(1)大鼠和家兔免前血清中，未检出H5N1血抑抗体和中和抗体。(2)大鼠对禽流感病毒敏感性高于家兔，但大鼠过于敏感。(3)第1针后14d，3种疫苗各剂量组的血抑抗体大部分达到1∶40或以上，但中和抗体都很低。(4)2针后14d，血抑抗体和中和抗体明显升高，但血抑抗体量-效反应不明显，而裂解-2疫苗的中和抗体量-效反应明显。(5)裂解-2疫苗接种大鼠和家兔的抗体反应，普遍高于另2种疫苗。

23 各型流感病毒和各型流感抗血清交叉中和试验结果(表1) 。

表1 各型流感病毒和各型流感抗血清交叉中和试验（略）

注：A为甲型流感病毒HINI；A3为甲型流感病毒H3N2；B为乙型流感病毒；A5为禽流感病毒R1194

从表1可知，各型流感抗血清仅能中和同型病毒。鸡胚病毒中和试验判断结果客观、重复性好，试验结果基本相似。

3 讨论

一般认为，由于H5N1禽流感病毒过去未在人群中发生流行，人体普遍无它的抗体，因而首次免疫所需的抗原量必须很大，故John等禽流感疫苗的人体观察结果，需要接种90μg 2针才有效〔2〕，此剂量超出普通流感疫苗剂量15μg 1针的12倍。然而随着研究的深入，发现在疫苗中加入佐剂，可显著提高免疫效果，疫苗免疫的有效剂量，从最早的90μg 2针立即降至30μg 2针〔3〕，以后又降至15μg 2针〔4〕，10μg 2针〔5〕，直至38μg 2针〔6〕。从禽流感疫苗研究的进展可知，变化的是剂量不断降低，但不变的是必须接种2针，这恰恰反应疫苗免疫接种的一般规律，即机体抵御新的抗原作出有效的反应，必须要多次接触才能完成。本研究发现，疫苗接种大鼠和家兔1针后14d，大鼠和家兔动物都能产生血抑抗体，滴度也可达1∶40或以上，但中和抗体滴度都很低，几乎测不到。本研究发现，普通流感和禽流感的血抑试验相互之间都有交叉反应，而单扩试验和中和试验则无交叉。可以认为，接种1针后，动物产生低滴度的血抑抗体可能是非特异的或无中和病毒能力的，又因为血抑试验本身存在很多问题〔7〕，影响因素多，方法不稳定，故用血抑抗体作为指标，不能正确反应疫苗的质量，必需观察中和抗体。普通流感疫苗的生产规程中，没有效力试验这一项，生产厂家拿到WHO推荐的生产毒株或类似株，不管是否做过临床试验就可生产，这是不科学的。临床试验应该包括3方面的内容，副反应、产生中和抗体的有效剂量和与其他型别的相互干扰。在目前研究中的禽流感疫苗，应该考虑增补效力试验，而且必须做病毒中和试验。本文研究结果表明，免疫家兔产生禽流感病毒的中和抗体量-效反应明显。又证明各型流感病毒和各型流感抗血清没有交叉，且方法稳定，判断客观，重复性好，因而提出禽流感疫苗的研究和生产必须有效力试验。建议合格标准：(1)临床前动物试验中，要求用15μg HA接种家兔1针，血清中和抗体滴度均达1∶40或以上。(2)在临床试验时，要求人体接种不同剂量疫苗2针后，血清中和抗体滴度达1∶40或以上，定为抗体阳转。(3)在疫苗生产、检定规程中，要求疫苗的血凝素(HA)剂量为临床试验时接种者抗体75% 阳转的剂量。本研究用R1203毒种，按3种不同工艺生产的疫苗，接种家兔和大鼠，均出现裂解-2疫苗的抗体反应较强，并超过全病毒疫苗，这似乎不好理解。现已知，抗体反应强弱与抗原量和抗原颗粒大小密切相关。从3种不同工艺生产疫苗的电镜形态观察可知，裂解-1疫苗，抗原颗粒虽多，却太细，妨碍它的免疫原性，再看裂解-2疫苗，由于裂解后的颗粒较大，因而可能仍有较好的免疫源性，且抗原颗粒数目远超过全病毒苗。再从电泳图看到，裂解-2疫苗的蛋白条带和全病毒疫苗没有差别，这些可能是它效果好的原因。

参考文献

〔1〕 国家药典委员会.生物制品生产和核定用菌种、毒种管理规程［S］.《中华人民共和国药典》三部.北京：化学工业出版社，2005：3-9.

〔2〕 John J, Treanor M D,James D,et al.Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine［J］.N Engl J Med, 2006,354(13)：1343-1351.

〔3〕 Bresson JL,Perronne C,Launay O,et al.Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion ifluenza A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine：phase I randomised trial［J］.Lancet，2006,367(9523)：1657-1664.

〔4〕 世界卫生组织(WHO).大流行流感疫苗法规指南［EB/OL］.http//.cn/SHW/nicpbp.nsf/svdocs/562711c41db727 ee4825.

〔5〕 Lin J, Zhang J,Dong X，et al.Safety and immunogenicity of an inactivated adjuvanted whole-virion influenza A (H5N1) vaccine：a phase I randomised controlled trial［J］.Lancet,2006,368(9540)：991-997.

〔6〕 英国葛兰素史克.禽流感疫苗临床试验成功［EB/OL］.http：///2006/04/07101739167.shtml

〔7〕 刘平，刘东，李彬，等. 禽流感血凝抑制试验存在的问题［EB］.http//.cn/yebio/ill/2004072806.htm