H5N1禽流感病毒及抗病毒新药的研究进展

摘要：禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是引起鸟禽类烈性传染病的病毒。1997年发现AIV跨越物种障碍使人感染。H5N1是有强致病力的禽流感病毒，感染H5N1的患者死亡率高。本文综述了禽流感病毒致病机制研究以及抗H5N1禽流感病毒新药的进展，包括：神经氨酸苷酶新抑制剂及核酸基的抗禽流感病毒新药――免疫调节双链核糖核酸聚ICLC脂质体和反义寡核苷酸。

关键词：H5N1禽流感病毒；致病机制；抗禽流感病毒新药；聚ICLC脂质体；反义寡核苷酸

中图分类号：R978.7文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)09-0058-04

Progress on H5N1 Avian Influenza Virus and New Antiviral Drugs

CHEN Zhi-zhong

(School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Abstract ：The avian influenza virus (AIV) is a strong virus infection in birds. In1997, it was found that AIV could infect human beings over the species barrier. H5N1 is a virus with strong pathogenicity, so the people infected by H5N1 show a high death rate. In this article, the progress on pathogenic mechanism of AIV and new anti-H5N1 drugs is reviewed, including a new neuraminidase inhibitor and a nucleic acid-based anti-avian influenza virus drug―immunomodulating liposome-encapsulated dsRNA poly ICLC and antisense oligonucleotides.

Key words：H5N1 avian influenza virus; pathogenic mechanism; new anti-avian influenza virus drug; liposome-encapsulated poly ICLC; antisense oligonucleotides

2003年下半年至2004年初在亚洲重新爆发的H5N1禽流感经各国政府的严防和控制基本扑灭。2006年底和2007年初东南亚又出现疫情，并发现人感染了禽流感。据报道，韩国的一名农场工人感染了禽流感。2007年印度尼西亚4例死于禽流感，从而印尼因禽流感死亡61人。2007年1月初我国报道了6个月来首例人感染禽流感病例，3月28日我国卫生部通报该病例于3月27日晚死亡。2007年12月江苏省卫生厅通报，经卫生部确诊1例人感染高致病性禽流感，12月2日死亡，患者无与病死家禽接触史。据统计，2003年以来，全世界有268例感染了H5N1型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV），160例死亡。科学家们担心，H5N1 AIV可能发生变异，并在人际传播，一旦爆发可能造成大范围感染或死亡。因此，对H5N1 AIV及抗病毒新药的研究是当前科学家和医药界研究的重点之一。

1禽流感病毒致病机制研究的新发展

AIV由两种不同糖蛋白构成其结构的外层。一种为血凝素（hemagglutinin，H或HA），另一种为神经氨酸苷酶（neuraminidase，N或NA）。HA有15个亚型，NA有9个亚型，HA与NA的不同组合形成了不同类型的AIV，笔者曾作介绍[1]。

AIV的致病机制一般先由病毒表面的HA介导病毒粒子与宿主细胞表面糖蛋白受体唾液寡聚糖结合，然后通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞并在宿主细胞中复制，新的病毒从宿主细胞中释放。AIV的NA具有唾液酶活性，可促进新形成的病毒从宿主细胞中释放[1]。图1为瑞典著名科技摄影师伦纳特・尼尔松拍摄的照片（原载于瑞典《每日新闻报》），图中显示一串子球状H5N1病毒正在攻击和破坏细胞。

流感病毒复制循环：病毒粒子从隐蔽到HA与神经氨糖酸（neuraminic acid）结合（binding），通过内吞作用（internalisation）进入宿主细胞，然后脱壳（uncoating），核糖白（ribonucleoprptein，RNP）进入病毒RNA的转录及合成（synthesis of viral RNA）、病毒蛋白质的翻译及合成（synthesis of viral proteins），并重组和成长（assembly and budding），随后从宿主细胞释放（libration），如图2所示。

2001年Lamb等在Kinpe等[2]编著的病毒学中指出：AIV白形成螺旋状基因RNP复合体的蛋白质骨架在病毒RNA复制中起关键作用。AIV白的全部折叠和拓扑结构与狂犬病病毒和小囊口炎病毒的结构不同，后两种病毒是由共线多肽序列形成的[3，4]。

2006年美国华裔科学家陶一之领导的研究小组报道了A型流感病毒，尤其是H5N1 AIV白形成低聚物和与RNA结合的机制[5]，白结晶结构如图3。a为白三聚物（A、B、C）单独观察三折叠轴，3个亚基用不同颜色显示，标以相关3个亚基的旋转角。b为侧面观察白三聚物，c为白二级结构说明（亚基B）。螺旋线和β链分别以表示，β链相对的记号形成反平行的β链。d为白亚基β，从蓝色到红色，标出了残基进行和继续发生紊乱的区域，并用虚线连接。

研究小组发现，AIV尾部的白会凝聚成小环状，并层层重叠成圆柱状。病毒的核糖核酸染色体组首先围绕圆柱复制病毒，然后侵入到其他细胞。陶一之等提取出了这种白，并认为如果能使白氨基酸发生改变阻止白形成圆柱状，就可以阻止病毒复制。专家们认为，这一发现为研究抗禽流感新药开辟了新途径。

(Larisa V Gubareva, et al. The Lancet, 2000, 355(9206): 828Fig 3)

病毒通过HA至末端含神经氨糖酸残基受体并穿透入宿主细胞；病毒RNA的转录及病毒蛋白质的合成；病毒RNA的复制并重组成长，从宿主细胞释放。

2抗禽流感病毒新药的研究

21世纪以前几乎没有有效拮抗AIV特别是高致病力H5N1的药物。研究表明，NA可促进流感病毒从感染细胞中释放，并推进病毒在呼吸道内伸展。因此抑制NA作为抗病毒靶点得到了重视，强有力和特异性的NA抑制剂使抗流感病毒药物获得了发展。2000年Gubareva等[6]报道了两种重要的NA抑制剂，即奥司他韦（Oseltamivir）和札那米韦（Zanomivir），用于抗A型人流感病毒。

2005年美国研究人员在《传染病学报》上报告了罗氏公司生产的抗A型人流感病毒新药――奥司他韦[商品名达菲（Tamiflu）]有助于控制H5N1禽流感病毒。首次将达菲用于感染H5N1禽流感病毒的小鼠进行实验，取得了较好的效果。通过临床应用得到了世界卫生组织（WHO）的认可。

2.1神经氨酸苷酶新抑制剂的开发

2006年Russell等[7]研究了H5N1 AIV分子表面NA的结构及其与奥司他韦的结合，并据此提出了抗H5N1禽流感新药设计的新的可能。X-射线晶体学显示，H5N1和H5N2病毒结构不同。研究表明，H5N1病毒的NA含有一个空穴邻近其活性位点，接近于配

位体结合（图4）。Russell等的研究结果表明，利用空穴的情况和位置有可能开发出抗禽流感新药。

2.2核酸基础的抗禽流感新药

1999年加拿大防护研究机构的Wong等与美国军队医学研究所Kende及美国国家变态反应和感染研究所的Levg报道了用免疫调节双链核糖核酸（immunomodulating dsRNA）抗流感病毒感染的脂质体免疫疗法[8]。

免疫调节的双链核糖核酸是一种合成的双链RNA，由聚核糖黄苷聚核糖胞苷酸（polyriboinosine polyribocytidylic acid，IC）组成，用聚-L-赖氨酸（poly-L-lysin，L）和羧甲基纤维素（carboxymethyl-cellulose，C）稳定，此免疫调节双链RNA称为聚ICLC。此品每1 mL 0.9 %氯化钠溶液中含IC 2.0 mg、聚-L-赖氨酸1.5 mg及羧甲基纤维素5 mg，是一种包于阳离子脂质体制剂，用冷冻干燥法制备。研究表明，聚ICLC可使感染A/PR/8(H1N1)/Aichi/Z(H2N2) 的小鼠生存率达到100 ％（P＜0.01），且毒性低，较安全。

2007年加拿大防护研究开发机构的Wong等和美国Oncovir公司的Salazar、OligosEtc公司的Dale及中国农业大学的两位教授共同报告了核酸基础的抗病毒新药，用于抗季节性流感病毒和抗禽流感病毒[9]。此新药为聚ICLC和反义寡核苷酸（antisenseoligonucleotides），聚ICLC的组成和包于脂质体的制备方法与1999年Wong等的报道相同。

核酸基础的抗禽流感新药研究进行了两个实验。一是用6～7周龄（体重20 g）的Balb/c雌性小鼠，经鼻给予包或未包脂质体的聚ICLC和反义寡核苷酸进行预防感染的实验。每组小鼠（8～10只）给予2个剂量的游离聚ICLC或聚ICLC脂质体（1 mg/kg），2次给药间隔48 h。在给药后的不同时间，以10倍半数致死量（LD50）的流感病毒A/PR/8/34或1～4倍LD50的H5N1鼻内感染免疫动物。每日监测动物感染症状、体重及生存状况，感染14 d后记录每组小鼠的生存数。第二个实验：以10倍LD50的流感病毒A/PR/8/34感染小鼠。感染8 h后经鼻给予游离或包于脂质体的反义寡核苷酸或随机对照序列。每日监测动物感染症状、体重及生存状况。感染14 d后记录每组小鼠生存数。不同实验组的小鼠生存数与对照组比较，经Logrank实验结果表明，有显著差异（P＜0.05）。

动物实验结果表明，聚ICLC脂质体对季节性流感病毒和禽流感病毒感染有防护作用，对流感病毒A型的各种亚型H1N1、H3N2和H5N1有对抗效应。对小鼠的药效研究表明，用反义寡核苷酸可以达到特异性治疗流感A型病毒的目的。反义寡核苷酸需要进一步设计，以抑制关键病毒复制所需基因的表达。反义寡核苷酸作用的模式是高特异性的在反义序列与病毒mRNA之间的互补碱基对，因此，此治疗方法的一个限制是需要相关的反义寡核苷酸混合，以提供对抗流感病毒亚型系列的广泛防护。

3展望

流感A型病毒，尤其是强致病力的H5N1禽流感病毒致病机制的研究已有了较大的进展。病毒的NA结构及其与抗病毒药物奥司他韦结合的研究为开发NA新抑制剂提供了基础。对H5N1致病的关键――病毒白的作用取得的成果，为新药开发找到了靶点。2007年报道的核酸基础的抗H5N1新药――聚ICLC脂质体和反义寡核苷酸，动物实验显示了前者预防H5N1病毒感染、后者治疗H5N1有良好效果。这类新药显示了高效和多用的特点，充分开发，将可能成为预防和治疗季节性流感和禽流感爆发时的新方案。

我们深信，随着医药科学的发展，抗H5N1病毒的新药将为预防和治疗禽流感开拓广阔的前景。

参考文献

[1]陈执中. 抗禽流感病毒天然药物的筛选[J]. 中国民族民间医药杂志，2006，（1）1-3.

[2]Kinpe D M, Homley P M. Fields virology[M]. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2001: 1487-1531.

[3]Aibertini A A, Wernimont A K, Muziol T, et al. Crystal structure of the rabies virus nucleoprotein RNA complex[J]. Science, 2006, 313(5785): 360-363.

[4]Green T J, Zhang X, Wertz G W, et al. Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNAcomplex[J]. Science, 2006,313 (5785): 357-360.

[5]Ye Q, Krug R M, Tao Y J. The mechanism by which influenza A virus nucleoprotein forms oligomers and binds RNA [J]. Nature, 2006, 444(7122): 1078-1082.

[6]Gubareva L V, Kaiser L, Hayden F G. Influenza virus neuraminidase inhibitors[J]. Lancet, 2000, 355(9206): 827-835.

[7]Russell R J, Haire L F, Slevens D J, et al. The structure of H5N1 avian influenza neuraminidase suggestsnew opportunities for drug design [J]. Nature, 2006, 443(7107): 45-49.

[8]Wong J P, Yang H, Nagata L, et al. Liposome-mediated immunotherapy against respiratory influenza virus infection using double-stranded RNA poly ICLC[J]. Vaccine, 1999, 17(13-14): 1788-1795.

[9]Wong J P, Christopher M E, Salazar A M, et al. Nucleic acid-based antiviral drugs against seasonal and avian influenza viruses[J]. Vaccine, 2007, 25(16): 3175-3178.