siRNA干扰人核糖核酸酶抑制因子在HeLa细胞中的表达鉴定

[摘要] 目的 鉴定已构建的干扰人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的siRNA表达载体pKD-dsRI的干扰效果。 方法 用脂质体法将所构建的pKD-dsRI与充当报告基因的重组绿色荧光蛋白融合hRI的逆转录病毒载体（pLNCX-EGFP-C1-hri）共转染到人宫颈癌HeLa细胞中。实验设4组：空白细胞组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1-hri转染组（对照组1）、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组（对照组2）及pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组（干扰组）。采用RT-PCR和Western blotting检测egfp-hri基因在转录后基因水平和蛋白质水平的表达。 结果 干扰组egfp-hri基因的mRNA转录水平和蛋白表达水平较对照组1与对照组2分别下降了91%、85%和83%、81%（P < 0.05）。 结论 已成功构建了针对hRI的siRNA表达载体。

[关键词] 人核糖核酸酶抑制因子；siRNA；鉴定

[中图分类号] R78 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）09（a）-0008-04

Identification of the effect of siRNA plasmid targeted combination hRI expressed in HeLa cell

LI Kun1 DING Ning1 LI Lin2

1.Department of Clinical Laboratory Medicine， Medical College of Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116021， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Maternal and Child Care Service Centre of Dalian， Liaoning Province， Dalian 116021， China

[Abstract] Objective To identify the silencing effect on human HeLa cells of a siRNA plasmid pKD-dsRI targeting the gene of human ribonuclease inhibitor （hRI）， which is capable of expression in mammalian cells. Methods The vector of pKD-dsRI was co-transfected into HeLa cells with the reporter plasmid of pLNCX-EGFP-C1-hri （transfection group）， using the cells transfected with the reporter plasmid of pLNCX-EGFP-C1-hri （control group 1）， empty plasmid of pKD together with pLNCX-EGFP-C1-hri （control group 2）， and those untransfected （no transfection group） as controls. The silencing effect was determined by RT-PCR， and the expression level of egfp-hri protein was determined by Western blotting respectively. Results The transcription level of the egfp-hri fusion gene in cells co-transfected with pKD-dsRI and reporter plasmid decreased by 91% and 85%， while the expression level of the egfp-hri fusion gene decreased by 83% and 81%， as compared with control group 1 and control group 2 respectively （each P < 0.05）. Conclusion The plasmid of siRNA targeting hRI is successfully constructed and the protein of hRI can be inhibited in cytomatrix of HeLa cells correctly.

[Key words] Human ribonuclease inhibitor； siRNA； Identification

恶性肿瘤一直是严重威胁人类健康的重大疾病之一。目前其临床治疗仍以传统的手术、放、化疗为主，具有很多缺点，如术后易复发、患者痛苦大、生存质量差、生存期短等。寻找和发现治疗肿瘤的新方法和新途径仍是当今医学研究的热点和难点。目前研究认为，实体瘤的生长依赖于新血管生成[1]，可以通过抑制肿瘤血管生成达到抗肿瘤作用，因而近年来正成为肿瘤治疗研究的热点领域。核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease Inhibitor，RI）是广泛存在于哺乳动物细胞浆内的酸性糖蛋白，能通过与血管形成因子（Angiogenin，Ang）紧密结合而抑制其活性[2]，进而抑制实体瘤血管的形成，从而抑制肿瘤的生长。因而RI可能为具有抗肿瘤血管活性的肿瘤抑制基因，有望应用于肿瘤的基因治疗中。为了进一步探讨RI的抗肿瘤机制，笔者构建了针对人核糖核酸酶抑制因子（hRI）基因的siRNA载体pKD-dsRI[3]。

为了验证该载体的干扰效果，本实验用重组绿色荧光蛋白融合hRI的逆转录病毒载体pLNCX-EGFP-C1-hri充当报告基因，将siRNA载体pKD-dsRI与报告载体共转染到人宫颈癌细胞HeLa中，验证siRNA表达载体的干扰效果。

1 材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞HeLa由大连大学医学院生物化学与分子生物学教研室（以下简称“本室”）保存；含H1启动子的针对hRI的siRNA表达载体pKD-dsRI由本室构建（图1）。

图1 siRNA表达载体pKD-dsRI

1.2 试剂

DL2000 DNA Marker、质粒提取试剂盒、DEPC H2O购自宝生物工程（大连）有限公司；梭华-SofastR基因转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司；RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、Trizol购于Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青血清生物制品有限公司；PVDF（聚偏二氟乙烯）膜购Biosciences；RT-PCR kit、ECL化学发光显色试剂盒购自Sigma公司；兔抗人核糖核酸酶抑制因子抗体由本室制备；RIPA蛋白裂解液购自KEYGEN生物；其他实验中所用的酚、氯仿、异丙醇等试剂均为分析纯。

1.3 细胞培养与转染

人宫颈癌细胞HeLa细胞在含10%胎牛血清、双抗（青霉素100 μ/mL，链霉素100 μg/mL）的RPMI 1640培养基于5%的CO2、37℃、90%湿度条件下培养。取对数生长期细胞按0.5×105～2.0×105/mL铺板于24孔板中，至细胞达到80%汇片时用梭华-SofastR转染试剂进行转染。分为四组：空白对照组（未转染组）、pLNCX-EGFP-C1-hri转染组（对照组1）、pKD+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组（对照组2）、pKD-dsRI+pLNCX-EGFP-C1-hri共转染组（干扰组），每组3复孔。每组质粒共用0.8 μg、脂质体2 μL，共转染组用pLNCX-EGFP-C1-hri 0.2 μg、pKD-dsRI 0.6 μg或pKD 0.6 μg。转染后48～72 h收获细胞。

1.4 转染细胞中RI基因mRNA转录水平的检测

转染24 h后，收获细胞。采用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA。使用RT-PCR试剂盒按照两步法进行RT-PCR反应。以总RNA逆转录合成的cDNA为模板进行PCR反应。ri基因上游引物：5'-gacatccagtgtgaggagctgagcg-3'，下游引物：5'-ccagcctcattgatgtcgttgttgc-3'，扩增产物约为527 bp；用于检测转染效果的pLNCX-EGFP-C1-hri质粒引物是上游引物：5'-tgatgtcgttgttgctaaccgtgag-3'，下游引物：5'-actctcggcatggacgagctgtac-3'，上游引物位于载体pLNCX-EGFP-C1-hri的egfp基因阅读框的No.697 bp，下游引物位于载体pLNCX-EGFP-C1-hri的MCS的下游位置，扩增产物为583 bp；内参β-actin 的上游引物：5'-gctgtccctgtacgcctctg-3'，下游引物：5'-tgccgatggtgatgacctgg-3'，扩增产物约为300 bp。反应条件为：94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 4 min，循环25次，72℃ 4 min。PCR产物由Bio-Rad凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Image LabTM软件对各个条带测定其面积及灰度值。用目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达强度。干扰率=相对表达强度空载体组-相对表达强度干扰组/相对表达强度空载体组。

1.5 Western-blotting法检测转染细胞中RI蛋白表达水平

转染72 h后，收获细胞。用含1 mmol/L PMSF的RIPA蛋白裂解液提取各组细胞总蛋白，取60 μg，经10%SDS-PAGE电泳后，电转转至PVDF膜，用5%脱脂奶粉37℃封闭过夜。加入RI一抗100 g/mL（1∶1000稀释）过夜；再用HRP标记的二抗IgG（1∶2000稀释）室温反应1 h，用ECL发光试剂盒反应液发光，曝光时间为30 s～5 min。由Bio-Rad 凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Image LAbTM软件进行定量分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.5统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测hri基因在转录后水平上的表达

RT-PCR半定量分析显示，未转染组细胞的RT-PCR产物在527 bp和300 bp处可见RI基因和内参β-actin基因条带，RI基因相对表达强度为（0.89±0.05）；对照组1和对照组2的RT-PCR产物在583 bp和300 bp处均可见egfi-hri基因和内参基因条带，egfi-hri基因相对表达强度分别为（1.69±0.32）和（1.03±0.09）；干扰组中egfi-hri基因相对表达强度为（0.15±0.04），与对照组1和对照组2相比，分别下降了91%和85%，差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

作为体内重要的调节分子，hRI具有多方面的功能[4-7]，这是由其特殊氨基酸序列及结构决定的，其一级结构含有大量的亮氨酸和还原型半胱氨酸，空间结构呈马蹄形，由富含亮氨酸残基重复区（leucin-rich reapeat，LRR）的α/β螺旋折叠结构多次重复构成[8-11]。目前研究发现在血小板糖蛋白Ib的α-亚基、人血清富含亮氨酸的α2-糖蛋白、酵母腺氨酸环化酶、果蝇的chaoptin和果蝇Toll蛋白等多种蛋白中广泛存在LRR结构域，且相关实验证明LRR结构域与膜和蛋白质、蛋白质和蛋白质的相互作用有关[12]。另一方面国内外研究认为，RI在正常细胞内，作为RNase抑制剂（Ki=4.0×10-14 mol/L），能够保护mRNA和rRNA，使蛋白质合成旺盛；作为血管生长因子抑制剂（Ki=7.1×10-16 mol/L），RI可以抑制肿瘤血管的形成[13-15，16-17]。此外，发现RI还具有抗机体氧化损伤的功能[18-19]。综上所述，笔者认为RI具抗肿瘤作用，可能为肿瘤抑制因子。

为证实这一推论，笔者构建了针对hri的siRNA瞬时载体pKD-dsRI介导hri基因的沉默。该载体是在H1启动子（RNA polⅢ）的作用下，产生发夹样RNA（short hairpin RNA，shRNA）使得hri基因表达沉默或下调。本研究将构建的pKD-dsRI与载体pLNCX-EGFP-C1-hri（绿色荧光蛋白融合hri基因载体）二者共转染到HeLa细胞中，以便于检测干扰效果。通过RT-PCR和Western blotting检测egfp-hri基因在转录后水平和蛋白质水平下的表达变化。RT-PCR和Western blotting结果证明，hri基因涉，干扰效果达到80%，从而说明干扰hri基因的siRNA载体构建成功。

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（收稿日期：2014-05-15 本文编辑：程 铭）