VEGF-siRNA在肾癌中的实验研究

【前言】VEGF-siRNA在肾癌中的实验研究由文秘帮小编整理而成，但愿对你的学习工作带来帮助。Department of Urinary Surgery, the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Province, Harbin 150001, China [Abstract] Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal carcino...

[摘要] 目的 研究血管内皮生长因VEGF在肾癌细胞中的表达，检测对肾肿瘤的影响。 方法 将针对血管内皮生长因子的RNA的模板区的siRNA转导肾癌细胞786-0中，采用免疫组化检测血管内皮因子VEGF的蛋白的表达，通过siRNA对血管内皮生长因子的抑制，减少肿瘤中血管的生成，从而抑制小鼠肿瘤的生长。 结果 通过siRNA对肾癌血管内的血管内皮生长因子的干扰，抑制了肿瘤血管的生长，减慢了肿瘤的生长速度。 结论 siRNA抑制血管内皮生长因子的表达，能明显减慢肿瘤的生长速度；肿瘤的生长速度与VEGF过度表达有关。

[关键词] 血管内皮生长因子；肾肿瘤；小鼠肿瘤体积

[中图分类号] R737.11[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2012）03（c）-0022-03

Experimental research of vegf-sirna in renal carcinoma

SUI Yudong WANG Xiaomin YANG Dejun WANG Keliang

Department of Urinary Surgery, the Fourth Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Province, Harbin 150001, China

[Abstract] Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal carcinoma cell, detect the influence to renal carcinoma. Methods siRNA contraposed RNA of VEGF in template area was transducted in 786-0 of renal carcinoma cell, detected albumen expression of VEGF adopt immunohistochemistry, reduced angiogenesis in tumour through inhibiting VEGF by siRNA, inhibited tumor growth of mouse. Results Through obstructing VEGF in artery of renal carcinoma by siRNA, tumor vessel growth had been inhibited, the velocity of tumor vessel growth had been revved down. Conclusion siRNA can inhibit the expression of VEGF, down the velocity of tumor vessel growth which has relation with overexpression of VEGF.

[Key words] Vascular endothelial growth factor; Renal tumor; Gross tumor volume of mouse

肾癌是泌尿系统中最常见的肿瘤，在治疗上通常采用的是手术治疗，但是在早期诊断时有大约30%的患者存在转移的现象，其转移的主要方式是血道转移和淋巴道转移[1]。肿瘤的转移是涉及很多因子的复杂过程，研究发现有很多因子参与转移过程，最值得关注的是血管内皮生长因子VEGF，其是通过旁分泌的方式释放，从而刺激肿瘤血管的生成，加快肿瘤的生长，VEGF不仅加快血管生长速度，也增加血管的通透性，Ferrara 等[2]报道中提及肾癌的肿瘤的生长是通过自分泌和有通透性的作用。为了减少肾癌的远处转移和抑制肿瘤的生长速度，采用了对siRNA和血管内皮生长因子的研究，探讨肾癌的治疗前景。

1 材料与方法

1.1 实验体外过程

1.1.1 实验材料肾癌细胞786-0由实验室自身提供，siRNA的设计：在Gene Bank查找编码人VEGF cDNA的序列，应用Ambion公司RNAi设计软件并参考有关文献，进行全基因组扫描和序列同源分析，设计针对VEGF mRNA不同剪接子的RNAi作用的公共靶点，上述由广东锐博合成所需的编码RNA，然后由该公司转导质粒中。

1.1.2 方法siRNA的合成：广东锐博根据提供参考的碱基对5′-ＧＡＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡ-3′（有义链）；3′

-ＧＴＧＧＡＧＴＧＧＴＴＣＣＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＴＣＡＣＧＡＣＣＧＧＡＡ

ＣＣＡＣＴＣＣＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡ-5′，合成目的siRNA。

1.1.3 质粒的转导和提取由广东锐博根据碱基序列合成所需的质粒，并由广东锐博将质粒转导大肠杆菌中，再放进摇箱进行摇晃，观察甘油菌的生长情况，同时加氨苄西林将非耐药的大肠杆菌杀死，使其含目的质粒的基因在大肠杆菌内大量繁殖。然后将质粒提取检测质粒，加入甘油进行保存。

1.1.4 培养细胞将实验室提供的肾癌786-0细胞系放置于人工培养液血清1640中，每24小时更换培养液，置于37℃温箱中进行繁殖、传代，冻存以备后期使用。

1.1.5 细胞分组和转染细胞将培养的肾癌细胞进行分组，分为空白组、目的组、含空质粒组、其他干扰因子组四组，转染前24 h，进行细胞准备，实验前24 h接种细胞，每孔细胞0.8×105个，密度为50%，第2天细胞密度增加至75%左右时，进行细胞转染。

1.1.6 检验转染是否成功将转染后的细胞进行传代繁殖，挑选状态好的细胞进行荧光下显像，观察细胞的形态以及分析是否转染成功，也可以通过RT-PCR技术检测是否转染成功。在图1中可以看出转染后的肾癌细胞呈现梭形，在荧光显微镜下能够看出荧光梭行肾癌细胞，结构完好，荧光显色均匀，未见肾癌细胞的破裂，转染成功。

1.1.7 WESTER-BLOT此步骤是为了检验蛋白产生，具体步骤如下：①先将细胞在超声下均浆破碎；②加入1.5 mL的裂解液，震荡混匀，冰上孵育30 min，离心，将上清液弃去，加入Nonidet P40至浓度0.6%，摇匀，冰上孵育10 min，将沉淀悬浮于0.5 mL的loading buffer 中，样品在冰上孵育30 min，2 000 r/min，4℃下离心10 min，将沉淀的蛋白分装，保存。将等量蛋白样品经10% SDS-J聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，以湿转法移到NC膜上，转移缓冲液转移条件为电流1 A，将时间调制1 h，转移后的NC膜经3% BSA室温封闭3 h，加入适当稀释的一抗，在4℃下过夜，用洗涤液buffer洗膜3遍，加入相应的二抗，在37℃下反应2 h，洗膜，以NBT/BCIP显色，水洗终止反应。在图2中能够清楚看见，在蛋白电泳中出现蛋白条带阳性，间接表示转染后的肾癌细胞中有转染后VEGF蛋白表达。

1.1.8 细胞生长曲线将肾癌细胞786-0制成细胞悬液接种于96孔板上，每孔浓度1×107/L，24 h后更换培养液，同时加入不同浓度的siRNA，每隔24 h取3孔做细胞计数，取平均值。

1.1.9 CCK-8法很多实验应用MTT方法，但是CCK-8在实验中具有简便、安全、精确的优点。步骤：接种细胞悬液于96孔板内，经37℃、5% CO2培养箱培养至细胞贴壁，再分别加入不同浓度的Ki67 siRNA,，每一浓度做3个复孔，并以negative siRNA和空白做对照，37℃下5% CO2培养箱培养72 h，有另外几孔已知数量的活细胞以备制标准曲线。将CCK-8试剂解冻，每孔加入10 μL，注意不能有气泡，放置培养箱4 h。用酶标仪检测在450 nm波长的吸光度，参照对照比630 nm波长。根据公式抑制率=（1-实验组A值/阴性对照A值）×100%计算抑制率。

1.2 体内实验部分

1.2.1 小鼠分组动物实验模型的建立与分组：给予正常的18只小鼠正常喂养，然后将小鼠标有数字，写在卡片上，放在暗箱中随机分组，将其分为3组，分别是目的组（VEGF），绿色荧光组（GPF），空质粒组（Control），每组6只小鼠，将小鼠进行同样饮食饲养，饲养天数为21 d。然后将体外培养好的带有目的基因的肾癌细胞，配制密度1.0×107个/mL，在每只小鼠的背部皮下注射细胞悬液约0.3 mL，然后正常喂养小鼠，其他两组依次按此法喂养。

1.2.2 计算测量肿瘤大小观察瘤体体积：在正常饲养小鼠的情况下，每隔1 d用卡尺测量最大直径的长度A和与之垂直的最大宽径B，利用公式得出相应结果，比较各组小鼠的生长情况，绘制肿瘤的生长曲线。

1.2.3 测量血管密度病理形态观察和免疫组化检测VEGF表达、血管密度。在实验结束后处死小鼠，取出肿瘤组织，应用常规HE染色，观察组织变化，用兔抗鼠VEGF作为一抗，按照说明进行SABC法免疫组织化学染色，随机在肿瘤的边缘与正常组织取平均值MVD，计算与同视野下的肿瘤细胞总数均值的比值，作为肿瘤细胞VEGF的表达阳性率MVD技术按Weidner评价标准进行。

1.3 统计学方法

利用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多个样本之间均数比较采用方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤细胞表达VEGF的阳性率

在目的组（VEGF）、绿色荧光组（GPF）、空质粒组（Control)的肾癌细胞中，应用免疫荧光法检测VEGF在肾癌细胞中的表达，在绿色荧光组（GPF）中和空质粒组阳性率很高，在目的组中很低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。

2.2 肿瘤生长曲线

含有VEGF的小鼠的背部的肿瘤体积随着时间的增长，三组小鼠的背部肿瘤的大小不一，在同一时间点上相比含有VEGF的小鼠肿瘤体积最小，VEGF组与GPF组、对照组相比，肾肿瘤的体积远远小于对照组和GFP组，对照组和GPF组相比，其肿瘤体积差异不大。见图3。

2.3 组织中血管密度

在三组小鼠中，通过SABC法免疫组织化学染色显示，在VEGF组中血管密度比其他两组在同期中都低，在对照组中血管密度最高，GPF组介于VEGF组和对照组之间，在同组中每只小鼠的血管密度变化不大，说明siRNA-VEGF在肾癌中具有抑制肿瘤生长的效果。见表1。

3 讨论

肾癌的治疗在临床上比较单一，主要是通过手术治疗，对放化疗不敏感免疫治疗在肾癌晚期治疗效果不理想。近几年通过对肾癌的研究，临床上有许多药物诞生，但价格比较昂贵，患者不能承受，笔者通过将si-RNA质粒转导肾癌细胞内，与Control组和GFP组相比较，发现细胞比Control组和GFP组生长缓慢，将三组含有不同质粒的肾癌细胞皮下种植小鼠皮下，建立动物的实验模型，测量三组动物实验模型肿瘤的直径大小，可以直观发现存在siRNA的肾癌的小鼠生长速度明显低于Control组和GFP组，生长速度也明显低于其他两组，Control组和GFP的体积大小以及生长速度明显高于VEGF组。GFP组的生长速度和在体小鼠的肿瘤大小无明显变化，通过免疫组化测量组织血管密度可以看出，三组小鼠组织的血管密度各不相同，其表现差异性很大，在VEGF组中，6只小鼠的血管密度与GFP组、Control组相比均小。在VEGF组的每只小鼠的组织血管密度相差不大，这与siRNA抑制血管内皮生长有很大关系，说明其能抑制肿瘤血管内皮生长的速度，间接抑制肿瘤的生长速度，直观上可见肿瘤大小以及体积远远小于GFP组和Control组。根据以上的实验研究，笔者可以得出siRNA-VEGF具有抑制肾癌细胞的生长作用，为临床起到指导作用，在药物的研发上起指导作用。

血管内皮生长因子属于多潜能因子家族，VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子VEGF的生物学作用是促进血管内皮生长，增加血管的通透性及血管生成维持其功能，此外还有促进内皮细胞的分裂[3]。最后还有细胞质的聚钙作用在正常肾脏可以表达，其含量和病变的程度呈正比[4]。

肿瘤的生长依赖血管以及生长因子的作用，其中VEGF对血管的生长有很大的作用，是决定血管形成的因素之一[5]。VEGF在许多恶性肿瘤组织中高水平表达，肿瘤组织中的高表达VEGF有利于肿瘤的生长与转移，有很多研究显示肿瘤生长组织中VEGF的表达很高[6-7]。在实验中Control组肿瘤细胞生长很快，而在VEGF组肾癌组织生长很慢，血管密度很低，说明VEGF的表达增高与肾癌的生长与侵袭有关。

肾癌是一种很容易转移的肿瘤，在临床上往往转移发生很早，转移的主要方式是淋巴转移和血道转移，其转移是一个很复杂的过程，也是一个动态过程，很多因子参与调控，几近年来发现VEGF是与实体肿瘤生长和转移有很大联系的一组生长因子，是以旁分泌的形式进行分泌，刺激血管形成，间接促进肿瘤的生长，在肿瘤的生长体积以及晚期转移的患者VEGF的表达水平高于早期患者。Oya等[8]报道，肾脏小血管以及小管是通过VEGF子分泌作用促进瘤的增生。在近年的研究中发现，VEGF与相应的疾病有关联，例如肾衰竭、代谢疾病、血管疾病，在不同的肾脏疾病中VEGF的表达不同。但是现在在肾癌的研究中，确定VEGF起着决定性的作用，现在有应用药物的治疗，例如舒尼替尼、索拉菲尼等药物的治疗。应用药物在最大限度上抑制VEGF和扩大潜在的抗肿瘤作用，现对这些药物组合安全性进行评估，所以不难看出，在发现VEGF之后为临床治疗提供了指导思想，为寻找其他有效因子作出了很好的实验模型，在今后肾癌治疗中有很好的指导意义。

[参考文献]

[1]肖建武.血管内皮生长因子与肾脏疾病研究进展[J].中国医药指南，2008，6（23）：

[2]Ferrara N，Gerber Hp，Couter J. The biology of VEGF and its recep-tors [J].2003，9（6）：669-676.

[3]Evelyhe D，Patricia H ，Ande V，et al.Tumor angiogenesis and tissue factor expression on during hepatocellular carci-noma progression in a transgenic mouse model [J]. J Hepatol，2003，38（6）：793-802.

[4]Thomton MV，Kudo D，Rayman P，et al. Degradation of NF-kappa Bin T cell by ganglliosides on re-cell carcinomas [J]. J Immunol，2004，172（6）：3480-3489.

[5]Sing AK，Gudehithlu KP，Pegoraro AA，et al. Vascular factors alterd in glucose-treated mesangial cells and diabetic glomeruli changes in vas-cular factors impair endothelial cell growth and matrix [J]. Lab Invest，2004，84：597-606.

[6]Carmeliett P. Angiogenesis in life disease and medicine [J]. Nature，2005，438（7070）：932.

[7]Siemann DW，Chaplin DJ，Horsman MR. Vascular-targeting therapies for treatment of m alignant disease [J]. Cancer，2004，100（12）：2491.

[8]Oya M，Takayanagi A，Horiguchi A，et al. Increased nu-clear factor-kappa B activation is related to the tumorde-velopment of renal cell carcinoma [J]. Carcinogenesis，2003，24（3）：377-384.

（收稿日期：2011-12-13本文编辑：郝明明）